2017 Fiscal Year Research-status Report

リプログラミング技術を用いた骨髄異形成症候群の腫瘍内遺伝的・機能的多様性の解明

Research Project

Project/Area Number	16K09847
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	蝶名林和久京都大学, iPS細胞研究所, 特定研究員 (00646010)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	骨髄異形成症候群 / リプログラミング / iPS細胞 / 腫瘍内多様性 / 新規治療薬
Outline of Annual Research Achievements	当初の研究計画に沿って、平成２９年度に下記の進捗があった。１）MDS-iPS 細胞の作製：引き続き、複数のMDS 及びMDSから移行したsecondary AML 症例（MDS/sAML）患者の末梢血及び骨髄の細胞から、MDS/sAML細胞由来iPS（MDS-iPS）細胞株と正常細胞由来iPS細胞株の樹立を行った。２）MDS/sAMLの病態再現：sAML症例由来のMDS-iPS細胞から分化した造血前駆細胞では、同一患者由来の正常iPS細胞と比較して、顆粒球・単球系コロニー形成能の有意な亢進が見られ、免疫不全マウスに生着し致死性のAMLを引き起こした。さらに移植したマウスの末梢血及び骨髄内に芽球や好中球の過分葉、pseudo-pelger核異常など、MDS/sAMLに合致した形態異常の所見が認められた。３）MDS/sAML特異的原因因子の探索：樹立したMDS-iPS細胞のうち、sAML症例由来MDS-iPS細胞の全エキソンシークエンスを行い、網羅的に遺伝子変異を探索し、いくつかのMDS-iPS特異的遺伝子変異を同定した。元の症例の腫瘍内多様性を反映して、MDS-iPS細胞にはFLT3変異を有する株（FLT3変異株）とFLT3変異を有さない株（FLT3野生型株）が認められた。各々から誘導した造血前駆細胞をマウスに移植したところ、FLT3変異株由来細胞を移植したマウスでは早期にAML様病態を呈し死亡した。４）新規薬剤スクリーニング：分化誘導系としては、血液前駆細胞を効率良く作成できる胚様体形成法を選択した。さらにスクリーニングの効率を上げるために、血液前駆細胞を大量に得られるよう細胞密度、サイトカインコンビネーションや分化誘導時間などの分化誘導方法の最適化を行った。５）候補因子の機能解析：３）により当該sAML症例においては、MDSからsAMLへの進展にFLT3変異が関わっている可能性が高いと考えられたため、FLT3野生型iPS株より誘導した造血前駆細胞にretrovirus vectorを用いて変異型FLT3を導入しマウスに移植したところ、白血病化が著明に促進された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成２９年度は、上記のように１）MDS-iPS 細胞の作製、２）MDS/sAMLの病態再現、３）MDS/sAML特異的原因因子の探索、４）新規薬剤スクリーニング、５）候補因子の機能解析を計画していた。１）、２）、３）についてはほぼ達成できた。４）については、薬剤スクリーニングの効率を上げるために、平成２９年度は血液前駆細胞の大量培養・分化誘導法の確立を行った。５）については、iPS細胞技術を用いて腫瘍内多様性に伴う様々な異常クローンの病態解析を行い、３）で同定したMDS-iPS特異的遺伝子変異のうちFLT3変異が当該sAMLの進展に関わる重要な因子の一つであることが確認された。以上のように、当初検討していた実験計画に関しておおむね順調に進展していると考えている。
Strategy for Future Research Activity	上記２）、３）、４）、５）の課題を引き続いて行う。４）新規薬剤スクリーニングすでに確立している胚様体形成法を用いた大量培養・血球分化誘導法を用いて、利用可能な化合物を上記のMDS/sAML病態再現系でスクリーニングして、分化異常の改善や異常クローンの増殖抑制などの効果を認めるような薬剤/化合物の選定を目指す。同定された薬剤に関しては、コロニーアッセイ、フローサイトメトリーによる細胞表面マーカー解析、ギムザ染色による形態学的手法、MTS細胞増殖アッセイ、２）のMDS/sAMLモデルマウスなどで薬効を評価する。５）候補因子の機能解析３）のMDS/sAML特異的原因因子の候補因子について、引き続きMDS-iPS 細胞に導入もしくはノックダウンして造血誘導を行い、４）と同様の方法により、分化異常や異常クローンの増殖に与える影響について評価する。有望な標的因子については阻害剤などの探索を行う予定である。当該sAML症例については、様々な異常クローンにおいてFLT3阻害剤の反応性の差異を上記のMDS/sAML病態再現系を用いて、in vitro, in vivoで検討する予定である。
Causes of Carryover	理由：平成29年度は骨髄異形症候群(MDS)-iPS細胞の作製、MDS/二次性急性骨髄性白血病(sAML)の病態再現、MDS/sAML特異的原因遺伝子の探索、新規薬剤スクリーニング、候補因子の機能解析をおこなった。病態再現においてMDS/sAMLの顕著な表現型がみられたため、当初の予定よりも少ない株数において病態再現・特異的原因因子の探索・候補因子の機能解析を行うことが可能であった。また、新規薬剤スクリーニングに関しては血液前駆細胞の大量培養・分化誘導法の最適化を集中的に行いスクリーニングの効率化に成功した。上記のように予定より少ない株数で解析を行うことが可能であったため、細胞培養・分化誘導やシークエンス解析等のコストが当初予定より少なくなり、未使用額が生じた。使用計画：上記理由のため、今年度は当初予定より薬剤スクリーニングを幅広く行うとともに、予定より解析対象細胞株数を増やすことによりより詳細な解析(特異的原因因子の探索、機能解析等)を行うこととした。未使用額はその経費に充てることとしたい。