2016 Fiscal Year Research-status Report
転写ネットワーク解析によるRunx1の造血制御メカニズムの解明
| Project/Area Number |
16K09857
|
|---|
| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
忠垣 憲次郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30416268)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥田 司 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30291587)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 転写因子 / RUNX1 / 造血幹細胞 / 標的遺伝子 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
Runx1による造血幹細胞の分化プロセスの機構の解明を目的として、Runx1の新規候補標的遺伝子の機能解析を行った。ES細胞分化（胚様体形成）モデルの網羅的遺伝子解析により得られた種々のRunx1依存性分子の中で、発現変化が顕著であった３種を新規候補標的遺伝子として選定し、以下の検討を行った。
（１）３種の候補標的遺伝子のプロモーター領域についてin silico解析でRunx1結合部位の存在の有無を調べた結果、それぞれに存在することが確認された。そこで、Runx1による転写活性化能をルシフェラーゼアッセイにて検討した。候補標的遺伝子のプロモーター領域とされるRunx1結合部位を含む転写開始点上流に位置するDNA断片をクローニンングし、各遺伝子プロモーター含有ルシフェラーゼアッセイベクターを作成した。次いで、24 well plateに播種したHeLa細胞に対し、リポフェクション法によりRunx1発現プラスミドと各ルシフェラーゼベクターを導入し、48時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。Runx1により３種の候補標的遺伝子の転写は正に活性化された。
（２）次に、候補標的遺伝子のプロモーター領域のRunx1結合部位付近にRunx1が結合しているかを確認するために、クロマチン免疫沈降法を行った。ヒト慢性骨髄性白血病由来のK562細胞に対し、Runx1抗体で免疫沈降させたDNA断片を鋳型にリアルタイムPCRにて相対定量比較を行った。その結果、３種のうち２種の候補標的遺伝子でコントロール領域と比較してRunx1結合部位付近で顕著なRunx1の結合を認めた。
以上より、３種の候補標的遺伝子はメカニズムの一つとしてRunx1が各遺伝子のプロモーター領域に結合し、その発現を制御する可能性が示唆されたことからRunx1の新規標的遺伝子である可能性が示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り選定したRunx1の３種の候補標的遺伝子について、クロマチン免疫沈降法とレポーターアッセイを行い、これらがRunx1の新規標的遺伝子であることが示唆される結果が得られたことから、ここまでのところ順調に計画が進行しているものと考えている。また、３種の候補標的遺伝子のうち、Runx1による発現作用を１種が正に、２種が負に制御されているものとして見出せたことは、これら候補標的遺伝子が今後Runx1による造血幹細胞の分化プロセス機構を詳細に解明していくうえで役に立つ遺伝子であると期待している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、まずRunx1による３種の候補標的遺伝子の転写作用がどのような生化学的特性を持つのか検討を進める。Runx1結合部位に結合しない変異型Runx1とRunx1結合部位に変異を施した変異型ルシフェラーゼベクターを利用し、Runx1作用が直接的か他の分子を介した間接的かを検討し、Runx1転写因子の候補遺伝子プロモーター領域に対する作用の評価を確定する。また、間接的な場合この転写作用に影響を与える因子はどのようなものかなどについて検討し、近傍に結合する他の造血関連転写因子群との機能協調や転写ネットワークの解明を試みたい。同時に候補標的遺伝子の発現作用についてタンパクレベルで検討したい。さらに、Runx1による標的がどのような生理的意義を持つのかについての解明も試みたい。まずはES細胞と候補標的遺伝子ノックダウンの系を用いてアプローチを試みたい。
|
-
[Journal Article] Systematic protein-protein interaction mapping for clinically relevant human GPCRs.2017
Author(s)
Sokolina K, Kittanakom S, Snider J, Kotlyar M, Maurice P, Gandia J, Benleulmi-Chaachoua A, Tadagaki K, Oishi A, Wong V, Malty RH, Deineko V, Aoki H, Amin S, Yao Z, Morato X, Otasek D, Kobayashi H, Menendez J, Auerbach D, Angers S, Przulj N, Bouvier M, Babu M, Ciruela F, Jockers R, Jurisica I, Stagljar I.
-
Journal Title
Molecular Systems Biology
Volume: 13(3)
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
-
-
-
-
-
