リンパ球の分化・増殖におけるアナモルシンの役割の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09871
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 柴山 浩彦 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (60346202)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金倉 譲 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (20177489) ; 織谷 健司 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (70324762)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: アナモルシン / コンディショナルノックアウトマウス / B リンパ球 / T リンパ球 / 鉄・硫黄クラスター / アポトーシス / p38MAPK

Outline of Annual Research Achievements

申請者らが抗アポトーシス分子としてクローニングしたAnamorsin（AM）は、その後の継続した研究により、鉄・硫黄（Fe-S）クラスターを形成する分子として機能している可能性が示されてきている。In vivoでの種々の細胞におけるAMの詳細な機能を明らかにするためAMコンディショナルノックアウトマウス（AM Flox/Floxマウス）を作製した。
本研究では、リンパ球の分化・増殖におけるAMの機能を明らかにするため、Bリンパ球、Tリンパ球特異的にAMを欠損させたマウスを作製し、それらのBリンパ球、Tリンパ球の機能を解析する予定である。
最初に、Bリンパ球のAMの機能を解析する目的に、CD19Creトランスジェニック（Tg)マウスとAM Flox/Floxマウスを交配し、CD19陽性Bリンパ球特異的にAMを欠損したマウスを作成し、その表現型を解析したところ、最終分化段階のBリンパ球のみが減少することが明らかとなった。さらに、各分化段階のBリンパ球を単離し、RNAseqによって、遺伝子の発現変化を野生型マウスのBリンパ球と比較したところ、AM KO Bリンパ球では、B cell receptorのシグナルでは、p38MAPKの活性化が起きていることが想定される結果であった。さらに、ウェスタンブロッティングなどで、p38MAPKのリン酸化を検討する予定である。
また、Tリンパ球のAMの機能を解析する目的に、CD4Creトランスジェニック（Tg)マウスとAM Flox/Floxマウスを交配し、CD4陽性Tリンパ球特異的にAMを欠損したマウスを作成し、その表現型を解析したところ、CD4陽性Tリンパ球のみならず、CD8陽性Tリンパ球の減少もみられた。今後、AMの作用点などを検討していく予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

先行しているBリンパ球でのAnamorsin（AM）の機能解析は、CD19陽性Bリンパ球特異的にAMを欠損させることで、マウス脾臓の白脾髄に存在するFOLⅠの分化段階（最終分化段階）Bリンパ球のみが、有意にアポトーシスを起こし、減少していることが判明した。この表現型は、B cell receptorからのシグナル伝達を担うBtkの欠損マウスと類似しているため、AM 欠損 Bリンパ球のBtkを検討したが、リン酸化などには野生型と比較し、差を認めなかった。そこで、AMのBリンパ球における作用点を明らかにするため、RNAseqをおこない、遺伝子発現の差を検討したところ、p38MAPKの活性が亢進している所見が得られた。現在、ウェスタンブロッティングをおこない、蛋白レベルでの解析をおこなっている。
Tリンパ球でのAMの機能解析は、CD4陽性Tリンパ球特異的にAMを欠損させることで、CD4陽性Tリンパ球のみならず、CD8陽性Tリンパ球も減少を認めた。今後、AMの作用点を検討するために、Bリンパ球のときと、同様に、RNAseqをおこない、遺伝子発現の差を検討する予定である。

Strategy for Future Research Activity

Bリンパ球におけるAnamorsin(AM)の機能については、p38MAPKの活性化を蛋白レベルで検討し、予想通りの差を認め、さらに、その下流の細胞周期関連蛋白の発現、p38MAPK阻害剤などを用いた検討をおこなうことで、Bリンパ球におけるAMの作用点が、p38MAPKであることを証明できれば、そこまでのデータを論文化し、発表する予定である。
Tリンパ球については、現在、CD4 Cre TgマウスとAM Flox/Floxマウスを交配し、CD4陽性Tリンパ球でのAMの機能解析を主に進めているが、Lck Cre Tgマウスも入手しているので、このマウスとAM Flox/Floxマウスを交配し、Lck陽性Tリンパ球におけるAMの機能解析も進めていく予定である。CD4の発現時期と、Lckの発現時期が異なるため、これらのマウスを解析することで、異なった分化段階のTリンパ球における、それぞれのAMの機能を明らかにできることが期待される。

Research Products

• [Presentation] Anamorsin plays important roles in B-cell development (2016)
  • Author(s): 濱中有理， 柴山浩彦, 谷村朗, 横田貴史, 江副幸子, 一井倫子, 石橋知彦, 土居由貴子, 長手泰宏, 織谷健司, 金倉譲
  • Organizer: 第78回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜, 神奈川
  • Year and Date: 2016-10-14
• [Presentation] Anamorsin is essential for B-cell terminal differentiation. (2016)
  • Author(s): Hamanaka Y, Shibayama H, Tanimura A, Yokota T, Ezoe S, Ichii M, Ishibashi T, Doi Y, Nagate Y, Oritani K, Kanakura Y
  • Organizer: 21st Congress of European Hematology Association
  • Place of Presentation: The Bella Center, Copenhagen, Denmark
  • Year and Date: 2016-06-11
  • Int'l Joint Research