2016 Fiscal Year Research-status Report

鉄過剰が免疫機能に及ぼす影響の解析

Research Project

Project/Area Number	16K09874
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	江副幸子大阪大学, 医学部附属病院, 講師 (90379173)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	金倉譲大阪大学, 医学系研究科, 教授 (20177489) 織谷健司大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (70324762) 水木満佐央大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (80283761) 藤田二郎大阪大学, 医学系研究科, 助教 (90608720)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	鉄過剰 / 制御性T細胞 / Th17
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、マウスの生体内で鉄過剰のモデルを作成し、それにより免疫担当細胞及ぼす影響を解析するとともに、その分子的機構についても解析する。 2016年度は、in vitro Treg・Th17細胞培養系の確立と鉄負荷の影響についての解析を行った。すでに確立しているin vitroにおけるTreg及びTh17細胞分化誘導の培養系を用い研究をおこなった。正常マウスの脾臓からナイーブT細胞をCD4+/CD62+細胞として分離し、CD3抗体、CD28抗体、IL-4、IFNγ、TGFβ存在下で培養すると、FoxP3陽性のTregに分化するが、IL-4、IFNγの代わりにIL-6、IL-1bを加えると、Th17への分化を誘導することができる。それらの分化誘導培養系において、培養上清に鉄を加えることにより、鉄がT細胞分化に及ぼす直接の影響を検討した。その結果、鉄を加えた場合、デキストランのみの添加に比べてTh17への分化が促進し、Tregへの分化が阻害され、マクロファージとの共培養において、同様の実験を行なったところさらにその傾向は増強した。 IL-4、INFγ、TGFβを加えたTregの培養系において、ナイーブT細胞からのサイトカイン産生について検討を行なった結果、IL-6の産生には影響がなかったが、IL-1bの産生が有意に増加していた。また、細胞内のSTAT3のリン酸化が増強していた。一方、Th17の培養系においては、サイトカインに、有意な違いを得ることはできなかった。Th17の培養において、サイトカインの産生に有意差を認めなかったにも関わらず、Th17の有意な増加を認めたことは、サイトカイン産生以外に鉄過剰によりTh17への誘導を促す要因があると考えられる。今後、その要因について検討する。鉄負荷によるTregとTh17の分化に及ぼす影響のメカニズムについてさらに検討を進める。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 申請書での計画では、平成２９年度に、in VitroのTreg Th17細胞の培養系の確率と鉄負荷の影響について解析することとしている。すでに確立しているそれぞれの培養系において培養上清に鉄を加えることによるTreg、Th17への分化への影響について解析した。また、当初の予定からサイトカインの産生と転写因子、STAT3、p38MAPKのリン酸化についても解析した。さらにROSの産生についても解析した。一方、環境の細胞からの影響として、抗原提示細胞としてのマクロファージの影響についても解析し、マクロファージ単独の培養における鉄の影響についても予定通り解析を行った。
Strategy for Future Research Activity	１．マウスの腸炎モデル、GVHDモデルの確率と鉄負荷の影響について検討腸炎モデルマウスとしては、DSS(dextran sodium ulfate)を経口投与することにより血便及び、体重減少を生じることが報告されている。この腸炎モデルにおいては、Th2細胞の関与や腸管粘膜のT細胞浸潤も認め、免疫昨日の関与が示唆されており、自己免疫性腸炎疾患のモデルと考えられている。一方、B1002マウスの骨髄細胞及び脾臓細胞を致死量照射したBalb/cマウスに移植し、GVHDを誘導する。それらのマウスにおいてさらに鉄を負荷する。または鉄キレートするなどにより、病態や細胞分画にどのような影響を及ぼすかについて検討する。マウスへの鉄負荷では、腸粘膜やその他の臓器への過剰鉄の影響が考えられ、純粋に免疫機能の乱れなどを解析することが困難になることが予想される。そのため、これらのモデルマウスにGFP、ラベルなどで選別可能としたナイーブT細胞を移植するなどにより、T細胞の特異的な機能や生体内の分化について解析することが可能になる。これらのモデルマウスに鉄を負荷または鉄キレートを行い。腸炎、GVHDの症状に及ぼす影響を検討する。また、これらのモデルマウスの鉄負荷において炎症細胞及びT細胞の分画を検討する。また、ELIZAを用いて継時的に血清中のサイトカイン濃度を測定し、病態形成への関与について検討する。２．疾患患者の検体を用いた免疫細胞の分化と病態関連についての検討頻回の輸血を繰り返す症例や、骨髄移植症例において末梢血のT細胞の分画と病態の関連について検討する。申請者らはすでにこれらの患者の細胞を文書によるインフォームドコンセントとともにいただき、保管している。それらを用いて研究を実施する。