2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒト細胞培養由来L-cysteineによるカルバペネム系抗菌薬失活効果の解析
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16K09947
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
竹村 弘 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (80301597)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | L-cysteine / L-cystine / カルバペネム薬 / 不活化 / 血清タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、平成25-27年度に科研費を受けた研究（基盤研究C 課題番号25461525）及び平成28年度からの本研究で、ヒト由来の各種培養細胞の培養上清がカルバペネム薬の抗菌活性を失活する現象は、培養上清中の細胞由来のL-cysteine（Cys）によって起こること、Cysは濃度依存的にIPMを失活すること、アミノ酸を含まない培養液中ではCysは検出されないこと、ウシ胎児血清（FCS）存在下ではIPMの失活効果が減弱することを解明し、さらにCysは、培地中に含まれるCysの酸化体であるL-cystine（LC）を細胞が還元して新生されることを明らかにした。
平成29年度は、細菌由来のカルバペネム分解酵素であるカルバペネマーゼ検出法であるCIM testを応用した、カルバペネム薬に対するCysの効果の評価系を確立し、主にこの実験系を用いてCysのIPM不活化効果に対するFCS、主要な血清タンパク質であるアルブミン（ウシ、ヒト）、グロブリン（ヒト）の影響を検討した。Cys 0.4mMを含む培養液中にIPM 10mg/L含有ディスクを浸漬して2時間培養すると、ディスク中のIPMが失活し、阻止円ができなくなるが、ディスクを浸漬する前に、FCSを加えた培地で培養すると、CysのIPM失活効果が培養時間、FCSの濃度に依存して減弱することが判った。FCS20%の培養液中では、FCS添加直後からCysの効果が減弱し、1時間培養後にはIPMの失活がまったく観察されなかった。この現象はアルブミン、グロブリンでも同様にみられ、ヒトアルブミンでは生体の血清中と同程度の濃度で即座にCysのIPM失活効果を阻害することが判った。この現象は培養液中の遊離Cys濃度の減少を伴っており、Cysが血清タンパク質、特にアルブミンと結合することで、IPM失活効果を失うことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、様々なヒト由来の培養細胞をある条件で培養すると細胞培養液中の抗菌薬（カルバペネム薬）が失活する現象のメカニズムの解明とより有効な抗菌薬療法の確立を、主な目的としてきた。上記のように、この現象における血清タンパク質の影響とそのメカニズムの解明という点では、今年度は大きな成果を得ることができたといえる。またこれまでの研究成果をまとめて論文にし、国際的な学術雑誌（in press）、学会等で報告することができた。このため達成度としては、(2) のカテゴリーとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年までの研究で、特定の条件で培養した細胞培養液の上清中ではカルバペネム薬が失活すること及び、この現象の大まかな挙動が明確になり、そのメカニズムとして培養細胞がLCを還元してCysを生成することが想定され、さらにCysのIPM失活活性は血清中のタンパク質とCysが結合することにより阻害されることが判った。今後は、Cysによるカルバペネム薬の失活活性の詳細を分析するとともに、細胞種や抗菌薬を変えて、その実態を検討し、in vitroの実験系に与える影響以外に、生体内での挙動、やアミノ酸製剤などの注射薬との相互作用なども解明したいと考えている。このために細菌由来のカルバペネム分解酵素であるカルバペネマーゼの様々な検出法（CIM test、カルバNP法など）を応用し、抗菌薬に対するCysの効果を評価できないか検討しようと考えている。
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| Causes of Carryover |
昨年までの研究で、特定の条件で培養したヒト細胞培養液の上清中ではカルバペネム薬が失活する現象の大まかな挙動、そのメカニズムとして細胞由来のCysによりカルバペネム薬が失活すること、Cysは細胞によるLCの還元によって産生されること、血清タンパク質によってCysの効果が阻害されることなどが判った。当初、これらの失活メカニズムの解明、原因物質の特定、失活効果に対する血清の影響のメカニズムの解明は難航し、外注検査を含めて研究費用がかさむと考えられていたが、考えていたよりも順調に特定でき、活性の挙動を解析する実験系も既存の方法で、比較的安価で行えたため、今年度の研究費が予定よりも少なくて済んだ。また今年度は、研究成果を学術論文にまとめて発表することができたが、来年度も引き続き国際的な学術誌、学会等で成果の報告を行う予定で、そのために研究費を繰り越して使用したいと考えている。
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