2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K09956
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
白土 東子 (堀越東子) 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 主任研究官 (60356243)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 感染疫学 / ノロウイルス / 血液型抗原 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ノロウイルスは小腸上皮に発現する血液型抗原を識別して感染する個体を決めている。ノロウイルス感染への感受性は個体の血液型によって異なる。しかし、ノロウイルスの流行拡大前後の疫学解析と、流行したウイルス株の血液型抗原への結合能の解析が両立されている報告はこれまでにない。本研究課題において、流行株の疫学解析と血液型抗原への結合能のin vitroにおける解析を両立させた研究を実施する。
本研究課題では、ネパールにおいて2009年を境に急激に流行を拡大させたGII.13遺伝子型株を解析の対象とし、以下の1)-3)の順に解析を進めることによって、ノロウイルスの血液型抗原結合能獲得が流行の規定要因であるという基本原理を証明する。1) ノロウイルスGII.13遺伝子型の感染拡大前のNPL2008株のウイルス様中空粒子（VLP）の作製、感染拡大後のNPL2009株のVLP作製、世界的流行株GII.4遺伝子型株またはGII.17遺伝子型株のVLP作製を行う。2) ELISA、SPRを用いNPL2008株VLP（感染拡大前）、NPL2009株VLP（感染拡大後）、GII.4遺伝子型株またはGII.17遺伝子型株VLP（世界的流行株）の血液型抗原結合能の評価を行う。3) NPL2009株（感染拡大後）の血液型抗原結合能獲得の鍵となるアミノ酸をNPL2008株（感染拡大前）のアミノ酸に置換したVLPを作製し、血液型抗原結合能の減弱または消失を確認する。
今年度は1)に取り組み、感染拡大前のNPL2008株のVLPの作出、感染拡大後のNPL2009株のVLP作出に成功し、電子顕微鏡下で粒子の形状を確認することが出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では、下記の1)-3)の順に解析を進めている。今年度は1)に取り組み、ノロウイルスGII.13遺伝子型の感染拡大前のNPL2008株のVLPの作出、感染拡大後のNPL2009株のVLP作出に成功し、電子顕微鏡下で粒子の形状を確認することが出来た。VLPは本研究課題の解析対象となる試料である。また、2)のELISA解析で用いるウサギ抗血清の作製にも必須の試料である。本研究課題において最も重要なVLP発現に成功したため「順調に進展している」と判断した。
1) ノロウイルスGII.13遺伝子型の感染拡大前のNPL2008株のウイルス様中空粒子（VLP）の作製、感染拡大後のNPL2009株のVLP作製、世界的流行株GII.4遺伝子型株またはGII.17遺伝子型株のVLP作製を行う。2) ELISA、SPRを用いNPL2008株VLP（感染拡大前）、NPL2009株VLP（感染拡大後）、GII.4遺伝子型株またはGII.17遺伝子型株VLP（世界的流行株）の血液型抗原結合能の評価を行う。3) NPL2009株（感染拡大後）の血液型抗原結合能獲得の鍵となるアミノ酸をNPL2008株（感染拡大前）のアミノ酸に置換したVLPを作製し、血液型抗原結合能の減弱または消失を確認する。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトに感染するヒトノロウイルスはヒトを唯一の感受性動物とし、感染モデル動物も培養細胞での増殖系も確立していない。ウイルス粒子の便への排出量は決して多くなく、in vitroでの解析に充分なウイルス粒子の調製は困難である。そこで、VLPの調製が有用であるが、VLP発現は容易ではなく、現在までに海外で発現の成功が報告されているのは約15株に留まっている。一方、代表者が所属する研究室では18遺伝子型25株のVLP発現に成功しており、代表者はこのうち13遺伝子型16株の血液型抗原19種類に対する結合パターンの解析を終えている。この13遺伝子型16株には2014年まで世界的に流行していたGII.4遺伝子型に属するNarita104株と日本国内の食中毒事例で分離されたGII.13遺伝子型Kashiwa47株を含む。
今後の研究を推進するため、既に解析を終えている13遺伝子型16株をコントロールに設定し、NPL2008株、NPL2009株のVLP-血液型抗原結合パターンの評価を行う。これにより、ウイルスカプシドタンパク質上の血液型抗原結合部位のアミノ酸変異が疫学的優勢に結びつくのか否かの検討を推進することが出来る。
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| Causes of Carryover |
平成28年11月に研究段階の2)に当たる「ELISA、SPRを用いたNPL2008株VLP、NPL2009株VLPの血液型抗原結合能の評価」で用いる合成糖鎖の5種の発注を行ったものの、「納品に数ヶ月を要する。」とメーカー側から回答があった。5種のうち2種が発注から4ヶ月後の3月末にようやく納品されたものの、3種が未だに納品されていない。1種が58,000-75,000円の高額な試料で有り、次年度使用額となった678,381円のうち350,00円分は5種の糖鎖の支払いに充てる予定であった分である。また、研究段階の2)ではELISAで使用するウサギ抗血清が必要となる。ウサギ抗血清の作製は外部業者への委託を検討しており、現在、抗原となるNPL2008株VLP、NPL2009株VLPの大量調製を進めている。次年度使用額の残り約300,00円分はウサギ抗血清の作製に充てる予定であった分である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度は、納品された2種の糖鎖で先ずELISA、SPRの立ち上げとNPL2008株VLP、NPL2009株VLPの糖鎖結合能の確認を行う。これらの基礎データを元に、平成30年度に実施を予定していた研究段階3)に当たる「NPL2009株の血液型抗原結合能獲得の鍵となるアミノ酸をNPL2008株のアミノ酸に置換したVLPを作製し、血液型抗原結合能の減弱または消失を確認する」をスタートさせる。
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Research Products
(1 results)
