ミトコンドリア関連新規髄鞘化障害遺伝子の機能解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09982
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 植松 貢 東北大学, 大学病院, 講師 (90400316)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 植松 有里佳 (沼田) 東北大学, 大学病院, 特任助手 (70735779)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ミトコンドリア / 髄鞘化 / マウス / ラット

Outline of Annual Research Achievements

今回の研究は、低分子RNAのミトコンドリア内への輸送に関与する新規候補遺伝子Xが中枢神経系に及ぼす影響について、症例の線維芽細胞やマウスを用いて病態解析を行い、さらに治療薬について検討することを目的としている。平成２８年度は、X遺伝子異常による神経細胞異常についての観察を行った。症例の線維芽細胞を神経細胞に直接分化させる方法(Direct reprogramming法、Xue Y et al. Cell 2013)を用いて、患者由来の線維芽細胞とコントロールの線維芽細胞について、レンチウイルスによるshRNAを導入して、ヒトPTBP1遺伝子をノックダウンした。ノックダウン翌日にピューロマイシンでセレクションし、その2日後にN3メディウム(DMEDF12、N２サプリンメント、bFGF)を加え、さらに7日後にCNTF、BDNF、GDNF、NT3を加えて、６日間培養することで、神経細胞への分化が起こる。線維芽細胞が神経細胞へ分化誘導されると神経細胞に発現しているβ3Tublinが発現し分化が確認できる。上記方法を用いて、現在神経細胞体や神経突起の伸長の異常の有無、あるいは神経細胞の細胞生存率の低下について、解析系を確立して検討を行っている。また、当科で新規作成した遺伝子Xのノックアウトマウスはほぼ胎内致死であり、予定していたオリゴデンドロサイトの初代培養系の確立が困難であった。Crisper/Cas9法を用いて症例のミスセンス変異の導入を試みたが、変異遺伝子の配列の問題で作成困難な状態が続いている。今後は、野生型マウスから作成したオリゴデンドロサイト前駆細胞の初代培養細胞を用いて、遺伝子Xをレンチウイルスを用いてノックダウンし、成熟に伴って発現が変化するマーカー蛋白の異常の有無などについて、免疫組織科学的な手法及びウエスタンブロットを用いた生化学的手法を用いて解析する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

使用予定だったノックアウトマウスが胎生致死であり、初代培養系が確立できなかった。Crisper/Cas9を用いて症例が持っているミスセンス変異導入がまだ成功しておらず、マウスを用いた中枢神経系の解析が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

マウスを用いた機能解析については、野生型マウスからオリゴデンドロサイトの培養細胞を樹立し、レンチウイルスによって遺伝子Ｘをノックダウンする系を確立して解析する予定である。髄鞘化への影響に関する解析は、ラットの脊髄を用いた系を確立する予定。最後に上記の確立した系を用いて、ミトコンドリア治療薬などが病態を改善できるかどうかを観察するのが最終目標である。

Causes of Carryover

遺伝子のノックアウトマウスが胎生致死であったため、予定していた培養系の解析ができなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

野生型マウスを用いてオリゴデンドロサイトの初代培養を確立し、レンチウイルスを用いたノックダウンを行って遺伝子解析を進める予定