2016 Fiscal Year Research-status Report
リポイド副腎過形成症モデルマウスと細胞株によるステロイドホルモン生合成機構の解明
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16K09996
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
石井 智弘 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (70265867)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | STAR / Star / 先天性リポイド副腎過形成症 / ステロイドホルモン生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、Star欠損ステロイドホルモン産生細胞株およびCre-loxPによる条件特異的Star欠損マウスを作成し、Steroidogenic acute regulatory protein（StAR）非依存性のコレステロール転送経路の制御機構、コレステロールエステル蓄積に伴う二次的障害の機序をin vitroおよびin vivoで解明することである。
1) Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成
マウスの副腎皮質腫瘍由来Y1細胞株にマウスStar遺伝子エクソン1を標的とする一対のtranscription activator-like effector nuclease (TALEN) 発現ベクターAをエレクトロポレーションで導入し、Star遺伝子の片アレルに5塩基欠失を持つY1細胞株を作成した。得られたStar片アレル5塩基欠失Y1細胞株に標的配列をずらしてデザインしたTALEN発現ベクターBをエレクトロポレーションで導入し、Starの対立遺伝子に1塩基欠失を持つY1細胞株（複合ヘテロ接合性変異）を作成した。得られた2クローンの細胞株について、ジブチル化cAMP刺激下でのStarのmRNA発現、蛋白発現ともに野生型Y1細胞株に比し有意に低下していることを確認し、今までに報告されていないStar欠損Y1細胞株が得られたことを証明した。
2）Star loxPホモ接合体マウス（Star floxedマウス）の作成
マウスStar遺伝子のエクソン7の翻訳領域をloxP配列で挟み、さらにFRT配列で挟んだneomycin耐性遺伝子（Neo）をloxP配列の間に挿入した相同組み換えベクターを作成した。この相同組み換えベクターをC57Bl/6N系統由来のマウスES細胞株へエレクトロポレーションで導入し、neomycinで選択した。PCR、サザンブロットでスクリーニングし、6クローンにおいて、Star遺伝子に相同組み換えを生じたES細胞株が得られたことを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成、Star loxPホモ接合体マウスの作成ともにほぼ計画通りに進行している。ただし、Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成に関しては、以下の2点において、研究計画を一部変更した。
1) ジフテリア毒素でオフターゲットをnegative selectionし、さらにpuromycin選択により一段階でStar両アレル変異Y1細胞株を作成する方法でなく、二組のtranscription activator-like effector nuclease (TALEN) 発現ベクターを用いて、二段階で複合へテロ接合性のStar両アレル変異Y1細胞株を作成する手法を採用した。
2) Star欠損株を作成する対象は、マウスの副腎皮質腫瘍由来Y1細胞株とマウスのLeydig細胞腫瘍由来MA10細胞株であったが、平成28年度にStar欠損株を得られたのはY1細胞株のみであった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成、Star loxPホモ接合体マウスの作成ともに、平成29-30年度の研究計画に沿って、以下のように推進していく予定である。
1) Star 欠損ステロイドホルモン産生細胞株の作成
平成28年度の研究で得られたStar欠損Y1細胞株を中心に、その性質を評価していく。具体的には、ステロイドホルモン産生能、コレステロールエステル蓄積、トランスクリプトーム解析を予定している。
2) Star loxPホモ接合体マウス（Star floxedマウス）の作成
引き続き、相同組み替えES細胞株から、Star floxedマウスの作成を進めていく。Star floxedマウスが得られた際には、CAG-Creリコンビナーゼ/Ert1トランスジェニックマウスやCyp17a1-iCreリコンビナーゼトランスジェニックマウスと交配し、条件特異的Star欠損マウスの作成とその表現型解析を予定している。
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| Causes of Carryover |
未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度の消耗品購入に充当する予定である
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