2016 Fiscal Year Research-status Report
オキシトシン受容体遺伝子の脳領域特異的エンハンサー探索：自閉症関連SNPとの関係
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16K10004
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| Research Institution | National Center of Neurology and Psychiatry |
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Principal Investigator |
井上 由紀子 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 疾病研究第六部, 科研費研究員 (30611777)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | オキシトシン受容体 / 自閉スペクトラム症 / ヒトBAC / エンハンサー / CRISPR/Cas9ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経伝達物質としてのオキシトシンは、脳内に広く分布するオキシトシン受容体を介して社会性行動に関わることが知られており、近年、自閉スペクトラム症を対象としたオキシトシン点鼻スプレーの臨床試験において、対人コミュニケーション障害改善が報告され注目を集めている。
オキシトシン受容体遺伝子のイントロン内に多数同定された自閉スペクトラム症関連SNP(一塩基多型)は、扁桃体などの脳構造変化および社会性コミュニケーション障害という表現型と相関するが、蛋白質をコードしないゲノム領域に位置するこれらの塩基配列の個人差が、オキシトシン受容体遺伝子発現にどのような影響を与え、神経回路網を変化させ、表現型に至るのかは未知のままである。
本研究ではゲノム操作技術を駆使して、社会性行動に関わる脳領域におけるオキシトシン受容体遺伝子の発現制御モジュール(エンハンサー)を同定し、エンハンサー内の塩基配列の個人差による受容体発現パターン・発現量変化が自閉症スペクトラムリスクを説明しうるのかを明らかにすることを目的としている。
実際の方法として、ヒトゲノム配列を有するBAC（細菌人工染色体）を用いてトランスジェニックマウスを作製し、マウス個体内でヒト固有のエンハンサー活性を可視化する。今年度は、オキシトシン受容体遺伝子座を含むヒトBAC・マウスBAC両方を購入し、トランスジェニックマウス作製を複数回試みたが、マウス飼育棟の設備トラブル等により十分な個体数が得られず、エンハンサー活性の可視化・同定が予定よりも進んでいない。一方で、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術をマウス受精卵に適用し、オキシトシン受容体遺伝子の終止コドン後に2A-EGFPカセットをノックインすることにより、この遺伝子の内在性発現の可視化を試みており、前述のBACトランスジェニックマウスによるエンハンサー同定に利用する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度は、オキシトシン受容体遺伝子座を含むヒトBAC・マウスBAC両方を購入し、大腸菌内でのトランスポゾン転移を利用して「最小プロモーター＋レポーター遺伝子」カセットを挿入した。このBAC DNAをマウス受精卵へインジェクションすることによりトランスジェニックマウスを作製すると、BACに含まれる全てのエンハンサー活性をレポーター遺伝子発現として捕らえ、可視化することができる。受精卵インジェクションを複数回試みたが、マウス飼育棟の設備トラブル等により、十分な個体数が得られず、エンハンサー活性の可視化・同定が予定よりも進んでいない。
一方で、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術をマウス受精卵に適用し、オキシトシン受容体遺伝子の終止コドン後に2A-EGFPカセットをノックインすることにより、この遺伝子の内在性発現の可視化を試みている。この実験では、簡便迅速なクローニング・フリーCRISPR/Cas9法、および研究室内で合成した長鎖一本鎖DNAを用いる受精卵エレクトロポレーションという新技術を取り入れており、効率のよいノックインマウス作製を見込んでいる。得られたノックインマウスは、前述のBACトランスジェニックマウスのレポーター遺伝子発現パターンと比較し、エンハンサー同定に利用する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、ヒトBAC・マウスBACを用いたトランスジェニックマウス作出により、オキシトシン受容体遺伝子のイントロン内に存在する自閉スペクトラム症関連SNP（一塩基多型）と受容体遺伝子発現調節活性（エンハンサー）との関わりについて検討する。CRISPR/Cas9ゲノム編集による受容体遺伝子座改変についても、引き続き実験を進める。
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| Causes of Carryover |
物品費が予定よりも少なかったため。消耗品の購入が予定よりも少なかったのは、試薬などを他研究課題と共用することにより、節約することができたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度も、今年度に引き続き実験用マウスや胚操作に必要な消耗品を購入する予定である。また、成果発表を学会で行うための旅費等を支出する。
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[Journal Article] Origins of oligodendrocytes in the cerebellum, whose development is controlled by the transcription factor, Sox9.2016
Author(s)
Hashimoto R, Hori K, Owa T, Miyashita S, Dewa K, Masuyama N, Sakai K, Hayase Y, Seto Y, Inoue YU, Inoue T, Ichinohe N, Kawaguchi Y, Akiyama H, Koizumi S, Hoshino M
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Journal Title
Mechanisms of Development
Volume: 140
Pages: 25-40
DOI
Peer Reviewed
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