2016 Fiscal Year Research-status Report
AAVベクター及びiPS細胞による非侵襲的な副腎皮質過形成症の遺伝子治療開発
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16K10005
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| Research Institution | National Center for Child Health and Development |
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Principal Investigator |
内木 康博 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 内科系専門診療部, 医師 (20470007)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝又 規行 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 分子内分泌研究部, 室長 (10260340)
深見 真紀 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 分子内分泌研究部, 部長 (40265872)
高田 修治 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, システム発生・再生医学研究部, 部長 (20382856)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 先天性副腎皮質過形成 / 遺伝子治療 / アデノウィルス随伴ウィルスベクター / 21水酸化酵素欠損症 / 11β水酸化酵素欠損症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は先天性副腎皮質過形成に対して非侵襲的な遺伝子治療の開発を目的とする。
本研究期間ではアデノウィルス随伴ウィルスベクターを用いて欠損した遺伝子を導入することを試みるが、線維芽細胞に感染性を有するAAV2ベクターにヒト21水酸化酵素の遺伝子であるCPY21A2を、副腎皮質に感染性を有するAAV9ベクターにマウス21水酸化酵素の遺伝子であるCyp21a1遺伝子を組み込んだベクターを作製した。
まずヒト21水酸化酵素欠損症1名の患者皮膚から初代培養して得られた線維芽細胞に対してAAV2ベクターを用いてCYP21A2遺伝子を導入したところ、CYP21A2遺伝子の発現と、培養液中に加えた17水酸化プロゲステロンが11デオキシコルチゾールに一部代謝されていることを確認した。
次にマウスの副腎皮質に対してAAV9ベクターを用いてCyp21a1遺伝子を導入した。このCyp21a1遺伝子発現とマウス血中のステロイド代謝物は現在測定中である。
また同じステロイド合成酵素の一つであるCPY11B1遺伝子はミトコンドリアで機能することから、ミクロゾームで機能するCYP21A2遺伝子とは異なり線維芽細胞ではステロイド代謝酵素活性が認められないため、11β水酸化酵素欠損症のモデルマウスを用いて副腎皮質へ直接AAV9ベクターを投与することでステロイド代謝の改善が得られるかを確認する目的で、ゲノム編集技術を用いてCyp11b1遺伝子のヘテロ欠損マウスを作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今回の研究期間でヒト21水酸化酵素欠損症の患者1名について実験を行い得た。患者皮膚検体は期間中に女児の外性器形成術が行われない限り得られない試料であるため、得られて幸いであった。
一方マウスを用いて副腎皮質にAAV9ベクターを投与した実験ではPCRを用いて遺伝子型を確認してから実験を行ったものの、投与前の採血におけるステロイド合成異常は軽微であった。よって投与後のステロイド代謝の改善も明らかに認められない可能性がある。このことより、出生後早期死亡が多いホモ欠損マウスではあるが次年度ではさらにCyp21a1遺伝子欠損マウスの作成数を増やして実験を行う必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cyp11b1遺伝子を組み込んだAAV9ベクターを作製する。また今研究期間で得られたCyp11b1ノックアウトマウスのヘテロ欠損マウス同士を交配してホモ欠損マウスを作製する。得られたCyp11b1ホモ欠損マウスの副腎皮質に直接AAV9ベクターを投与しCyp11b1遺伝子の発現を確認することと、それによってステロイド代謝が改善されたか否かをマウス血中のステロイド分析を行って確認する。
同様に今研究期間で作製したCyp21a1遺伝子を組み込んだAAV9ベクターを自然発生で得られたCyp21a1遺伝子欠損マウスの副腎皮質に直接投与してCyp21a1遺伝子の発現を確認することと、それによってステロイド代謝が改善されたか否かをマウス血中のステロイド分析を行って確認する。
さらにヒトCYP21B遺伝子欠損症の患者から得られた線維芽細胞にCYP21A2遺伝子を組み込んだAAV2ベクターを感染させて、CYP21B遺伝子の発現と21水酸化酵素活性を確認する実験を患者数を増やして行い、人体での有効性を確認する。
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| Causes of Carryover |
本年度はCyp21a1遺伝子欠損マウスが複数匹作製できなかったために解析費用に余剰が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度はCyp21a1遺伝子欠損マウスならびにCyp11b1遺伝子欠損マウスの2つの疾患モデルについて遺伝子治療の効果を解析するため、その解析費用に使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
