2020 Fiscal Year Annual Research Report
Detection and clinical application of pilocytic astrocytoma minimal residual disease
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16K10011
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
渡辺 祐子 国立研究開発法人国立がん研究センター, 中央病院, 医員 (40610671)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
市村 幸一 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (40231146)
中野 嘉子 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (00796005)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | リキッドバイオプシー / 神経膠腫 / BRAF V600E / BNAクランプ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腫瘍検体収集が順調にすすまなかったため、同じ神経膠腫のうちBRAF V600E変異が検出されている退形成性星細胞腫の髄液中のcfDNAを用いたリキッドバイオプシーに、内容を変更した。BNA(Bridged Nucleic Acid：人工核酸ヌクレオチドの総称でRNAやDNAと強く結合する）クランプ法を用いることで、髄液からのBRAF変異検出率が上昇した。
【方法】低頻度のものを検出するために、今回はdigital PCR法とBNAクランプ法を用いた、サンガーシークエンンスの両者の評価法を用いた。また、クランプシークエンス法では配列も確認できる利点がある。検体はBRAF V600E陽性の退形成性星細胞腫髄液で、陰性コントロールとして原発性中枢リンパ腫、BRAF陰性脳腫瘍の髄液を用いた。陽性コントロールとしてはBRAF陽性腫瘍由来ctDNAを用いた。cfDNA抽出はQIAGENプロトコールに準じ、Bioanalyzer systemで確認した。BRAF TaqMan dPCR Liquid Biopsy Assay (ThermoFisher)とQuantStudio 3D Digital PCR systemを使い、BRAF BNA Real-time PCR kit (Riken Genesis)のBNAとprimerを使用して解析した。
【結果】髄液の上清からcfDNAが抽出され、腫瘍由来と考えられるBRAF V600EがdPCRにより検出された。なお、BRAF V600E の割合は腫瘍の増悪、縮小を反映する可能性がある結果であったが、検証が必要だった。BNAの添加を用いて変異頻度の少ないBRAF V600Eを検出で
きたが、BNAを添加しないサンプルでは変異は検出されなかった。BNA添加しないと変異頻度は約10％が限界、添加あると0.05％も検出可能だった。
以上は、Utility of a bridged nucleic acid clamp for liquid biopsy: Detecting BRAF V600E in the cerebrospinal fluid of a patient with brain tumor.Y Nakano, Y Watanabe, et al. Pediatr Blood Cancer. 2020;67:e28651.に報告をした。
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