薬物動態解析と代謝酵素活性分析による安全かつ効果的な小児造血細胞移植術の確立

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10033
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 河野 嘉文 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (20260680)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 児玉 祐一 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (20535695) ; 岡本 康裕 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (30398002) ; 西川 拓朗 鹿児島大学, 医歯学域附属病院, 講師 (90535725)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 造血細胞移植術 / busulfan / cyclophosphamide / 心毒性 / GST

Outline of Annual Research Achievements

造血幹細胞移植成績の向上に伴い、移植時の副作用の軽減や移植後の晩期合併症予防の観点から、busulfan(BU)・cyclophosphamide (CY)を含む移植前処置の安全性は重要な課題になっている。BUとCYは共通してGlutathione S-transferases (GST)という酵素の触媒反応を受けGlutathione (GSH)抱合という代謝を受ける薬剤である。今回、GST活性、GSH濃度を測定し、血中薬物・代謝産物の動態との関係を明らかにすることを目的とした。
まずはin vitroの実験系で、マウス心筋細胞へCY代謝物の一つであるhydroxycyclophosphamide(HCY)、acroleinを曝露し、GSH濃度をELISA法で測定した。するとマウス心筋細胞内のGSH濃度は低下した。しかし、GSHの前駆物質であるN-acetylcysteine(NAC)を前処理して曝露するとGSH濃度は上昇し、HCY、acroleinによるGSHの減少を抑制し、かつ心筋細胞障害までも抑制することを見出した。次にin vivoの実験を行った。6週齢のメスのC57BL/6JマウスにNAC前処理した群ならびに生食投与群を作り、その後CYを腹腔内投与し、CYならびにCY代謝物のHCY、carboxyethylphosphoramide mustard(CEPM)の濃度をLC/MS/MS法で、肝臓のGSH濃度を測定した。その結果、GSH濃度はNAC濃度依存的に増加し、CY投与群で減少することが判明した。また、我々の測定系でマウスのHCY、CEPMの血中濃度測定も行うことができ、その薬物動態も解析することができた。HCYならびにCEPMの薬物動態（AUC：薬物血中濃度－時間曲線下面積）はNAC投与群、非投与群では大きな差は認められなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

in vitroの実験で、CY代謝物曝露とNAC投与によるGSH濃度に与える影響を検討したところ、予想通りCY代謝物曝露でマウス心筋細胞内のGSH濃度が低下し、NAC投与でGSH濃度が上昇し心筋障害を抑制することができた。これは、本研究のテーマであるアルキル化薬の副作用にGSHが重要な役割を果たしている可能性を示唆させた。
in vivoの実験でもNAC投与により、GSH濃度がNACの濃度依存性にあがることも確認できた。in vitroの実験系で、NAC前処理によりCY代謝物曝露の心筋細胞障害を抑制することを証明しており、in vivoでもNAC投与によるCY心筋障害などの毒性の予防の可能性が期待できる。また、当初マウスでのCY代謝物測定が、検体量の問題で困難が予想されたが、今年度測定し、薬物動態を解析できることが確かめられた。
臨床検体は今年度BUを前処置として用いた造血幹細胞移植が1症例、CYを用いた移植が4症例あり、全ての症例で研究参加の同意を得ることができ、血液を採取することができた。BU/CY/CY代謝物濃度の測定は行なうことができているが、GSH濃度測定やGST活性測定は検体数をもう少し集積してまとめて測定する予定である。
以上より、今後予定している実験の大部分が少なくとも実現可能なことを確認でき、臨床研究だけでなくin vivoの実験系も確立できそうである。臨床検体の集積もできているので、初年度としてはおおむね順調に進展していると評価した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、まずはマウスでのCY投与下、NAC前処理併用下でのGST活性（血液、肝臓）を行ない、GST活性の測定を確立する。また、今年度in vivoで測定できなかったacroleinの測定を行い、acroleinの動態をNAC前処理ありの時となしの時で比較していく。また、CY投与群、NAC前処理ありCY投与群での心筋細胞の病理学的差の検討も行っていく。いずれの条件下のGSH濃度も肝臓だけでなく心筋細胞や血液での測定を計画している。
BUにおいても、同様にBU投与群、NAC前処理併用群、それぞれのGSH濃度（血液、肝臓、心臓）、GST活性（血液、肝臓）、BU血中濃度を測定する。その後、CY群とのGSH濃度、GST活性の比較を行う。最終的には、BUとCYを連続して投与を行い、GSH濃度（血液、肝臓、心臓）、GST活性（血液、肝臓）を測定する。BUとCYの投与順変更の影響も検討する。
臨床血液検体は、ある程度集積されれば、マウスと同様な方法で血液中のGST活性、GSH濃度測定を行なう予定である。

Causes of Carryover

予定していた臨床血液検体でのGST活性、GSH濃度測定を行なわなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

臨床血液検体でのGST活性、GSH濃度測定を行う予定。