2016 Fiscal Year Research-status Report
hSNF5による RUNX制御機構の解明と悪性ラブドイド 腫瘍発生病態の解明
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16K10038
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
桑原 康通 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30590327)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥田 司 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30291587)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | RUNX1 / SNF5 / Rhabdoid腫瘍 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1．RUNX familyとSNF5の相互作用
RUNX1とSNF5を細胞株へ強制発現させ、これらがタンパクとして発現し、会合しているかを免疫沈降法やWestern blot法によって確認したところ、RUNX1とSNF5は共沈降しタンパク同士の相互作用を確認した。SrcによるRunx1のチロシン残基のリン酸化が、SNF5との会合の上で重要か検証するために、Srcや変異Srcの発現ベクターを作成した。キナーゼ活性をもったSrcをRUNX1と共発現しRUNX1のチロシン残基のリン酸化状態を確認したところ、キナーゼ活性を持つSrcによってRUNX1のチロシン残基はリン酸化されていることが分かった。さらに、HAタグを付けたRUNX1のチロシンリン酸化部位変異体を、リン酸化を受けないチロシン残基としてはフェニルアラニン変異体を、恒常的リン酸化残基を模倣するアミノ酸としてはアスパラギン酸へのミスセンス変異体を作成した。RUNX1のチロシン残基がSrcによってリン酸化されていること、SNF5とのタンパク同士の結合が確認できたことにより、RUNX1のチロシン残基のリン酸化とSNF5との相互作用を免疫沈降法、ルシフェラーゼアッセイ等による検討をさらに進める予定である。
2．マウス個体レベルでのRUNX familyとhSNF5の相互作用の検討。
Runx1+/-マウスはすでに研究室に存在する。Rhabdoid腫瘍を発生するSnf5+/-マウスの精子をは研究協力者のノースカロライナ大学のWeissman教授から供与された。現在、受精によってSnf5+/-マウスを個体化しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RUNX1、RUNX1チロシンリン酸化部位変異体のSNF5、Srcや変異Srcの発現ベクターの作成が完了しRUNX1のチロシン残基がSrcによってリン酸化されていること、SNF5とのタンパク同士の結合が確認できており、RUNX1のチロシン残基のリン酸化とSNF5との相互作用を免疫沈降法、ルシフェラーゼアッセイ等による検討をさらに進めるための根拠を得ているため、予定通り進行しているといえる。Runx1+/-マウスはすでに研究室に存在する。Snf5+/-マウスの精子をは研究協力者のノースカロライナ大学のWeissman教授から供与され、受精によってSnf5+/-マウスを個体化しているが、精子の国内への移送に予定よりも時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
RUNX1のチロシン残基のリン酸化とSNF5との相互作用をRUNX1、RUNX1チロシンリン酸化部位変異体のSNF5、Srcや変異Srcの発現ベクターを組み合わせて、免疫沈降法、ルシフェラーゼアッセイ等による検討を進める。RUNX1とSNF5の会合に重要となるRUNX1のリン酸化部位を特定する。恒常的リン酸化模倣変異体と非リン酸化模倣変異体を用いて、RUNX1の転写調節に対する影響やSNF5との機能協調についてさらに検討を進めていく。また、RUNX1+/-マウスと掛け合わせ、Snf5+/+：Runx1+/－、Snf5+/－；Runx1+/+、Snf5+/+：Runx1+/+、Snf5+/－：Runx1+/－のそれぞれの遺伝型マウスのコホートを作製し、Snf5欠失によって誘導されるラブドイド腫瘍発生に与える遺伝学的背景や、Runx1変異による血球異常に対する影響を調べ、個体レベルでの機能協調を明らかにしていく予定である。もしも造血系あるいは腫瘍形成に関わる表現型が観察されれば、in vitro実験や細胞レベルの検討によってその分子メカニズムの確認実験へと進めてゆく予定である。
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