ミトコンドリア選択的オートファジー障害による先天性溶血性貧血の病態解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10041
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 菅野 仁 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (70221207)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小原 洋志 東京大学, 医科学研究所, 特任講師 (40528733)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 先天性溶血性貧血 / iPS細胞 / 赤芽球分化 / オートファジー

Outline of Annual Research Achievements

全国の医療機関から依頼を受け、平成28年4月～平成29年3月までの1年間で73例の先天性溶血性貧血症例の検査を実施した。その結果、全体の約80%の症例に診断を確定出来た。
赤芽球分化過程におけるミトファジー関連遺伝子の発現変動を検討するため、iPS細胞を用いた分化誘導系を確立した。末梢血単核球より抗CD3抗体およびIL-2存在下で増幅したTリンパ球にセンダイウイルスを用いてリプログラミング4因子を導入した。得られたiPS細胞の品質評価のために、フローサイトメトリー解析および免疫蛍光染色により多能性マーカー発現に問題がないことを確認した。
iPS細胞の赤芽球への分化誘導は、次のように2段階の方法で行った。1）胚様体形成法によりCD34陽性未分化造血細胞を分化誘導した。2）分離したCD34陽性細胞をサイトカインの存在下でさらに培養し、CD235a陽性細胞を得た。CD235a陽性細胞の発現遺伝子をSurePrint 3G Human GEマイクロアレイ（アジレント社）で検出し、GeneSpring GX 14.5ソフトウェアを用いて解析した。
ミトファジー関連遺伝子10種（ULK1、BECN1、PIC3C3、AMBRA1、PRKAA1、ATG9A、TBC1D5、NIX、BNIP3L、FUNDC1）のうち、この分化誘導系で遺伝子発現を検出出来たのはAMBRA1、BNIP3L、FUNDC1およびTBC1D5の4種類であった。
以上より、原因未確定の先天性溶血性貧血症例に対する変異解析の対象とするミトファジー関連遺伝子は、上記4種類の遺伝子とすることに決定できた。今後、遺伝子変異スクリーニングで候補遺伝子変異を同定出来た場合、正常iPS細胞へのゲノム編集により患者遺伝子変異を導入し、確立した赤芽球への分化誘導系により、変異の意義を検討することが可能になると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

iPS細胞から赤芽球系への分化誘導系を確立し、遺伝子発現解析が可能になった。
現在先天性溶血性貧血関連67遺伝子のターゲットシークエンシング解析を実施しているが、H28年度の研究成果により、今後ミトファジー関連遺伝子4種を追加する方針を決定することが出来た。
成熟赤血球における残存ミトコンドリア、ミトコンドリア膜電位差およびオートファジーマーカーLC3の解析に関しては、機器の老朽化による測定不良で条件検討が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

先天性溶血性貧血の特殊検査受託例を更に増やすと同時に、原因未確定例を対象としたターゲットシークエンシングを開始する。
フローサイトメーターについては既にメンテナンスが終了している機器のため、早期に機種変更して、予定通りに研究を進めていく予定である。

Causes of Carryover

H28年度の研究計画にある先天性溶血性貧血症例の生化学的解析に用いる分光光度計が使用不可能となった為、急遽次年度分を前倒しして請求し、購入費用に充てた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

生化学的解析で、赤血球酵素異常症、膜異常症、ヘモグロビン異常症が否定された症例についてICを取得後、順次ミトファジー関連遺伝子のターゲット・リシークエンスを行う。

Research Products

• [Journal Article] Exome sequencing identified RPS15A as a novel causative gene for Diamond-Blackfan anemia (2017)
  • Author(s): Ikeda Fumika、Yoshida Kenichi、Okuno Yusuke、Shiraishi Yuichi、Tanaka Hiroko、Chiba Kenichi、Muramatsu Hideki、Kanno Hitoshi、Ohga Shouichi、Ohara Akira、Kojima Seiji、Kenmochi Naoya、Miyano Satoru、Ogawa Seishi、Ito Etsuro
  • Journal Title: Haematologica Volume: 102 Pages: e93-e96
  • DOI: 10.3324/Haematol.2016.153932
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Diagnostic challenge of Diamond-Blackfan anemia in mothers and children by whole-exome sequencing (2017)
  • Author(s): Ichimura T, Yoshida K, Okuno Y, Yujiri T, Nagai K, Nishi M, Shiraishi Y, Ueno H, Toki T, Chiba K, Tanaka H, Muramatsu H, Hara T, Kanno H, Kojima S, Miyano S, Ito E, Ogawa S, Ohga S
  • Journal Title: Int J Hematol. Volume: 105 Pages: 515-520
  • DOI: 101007/s12185-016-2151-7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical Utility of next-generation sequencing for inherited bone marrow failure syndromes (2017)
  • Author(s): Muramatsu H,Okuno Y,Yoshida K,Shiraishi Y,Diosaki S,Narita A,Sakaguchi H,Kawashima N,Wang X,Xu Y,Chiba K,Tanaka H,Hama A,Sanada M,Takahashi Y,Kanno H,Yamaguchi H,Ohga S,Manabe A,harigae H,Kunishima S,Ishii E,Kobayashi M,Koike K,Watanabe K,Ito E,Tanaka M,Yabe M,Ogawa S,Miyano S,Kojima S
  • Journal Title: Genet Med Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1038/gim.2016.197
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Erythrocyte glutathione is a novel biomarker of Diamond-Blackfan anemia. (2016)
  • Author(s): Utsugisawa T, Uchiyama T, Toki T,Ogura H, Aoki T, Hamaguchi I, Ishiguro A, Ohara A, Kojima S, Ohga S, Ito E, Kanno H.
  • Journal Title: Blood Cells, Molecules and Diseases Volume: 59 Pages: 31-36
  • DOI: 10.1016/j.bcmd.2016.03.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PIEZO1 gene mutation in a Japanese family with hereditary high phosphatidylcholine hemolytic anemia and hemochtomatosis-induced diabetes mellitus (2016)
  • Author(s): Imashuku S,Muramatsu H,Sugihara T,Okuno Y,Wang X,Yoshida K,Kato A,Kato K,Tatsumi Y,Hattori A,Kita S,Oe K,Sueyoshi A,Usui T,Shiraishi Y,Chiba K,Tanaka H,Miyano S,Ogawa S,Kojima S,Kanno H
  • Journal Title: Int J Hematol Volume: 104 Pages: 125-129
  • DOI: 10.1007/s12185-016-1970-x
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] ALDH2 polymorphism in patients with Diamond-Blackfan anemia in Japan (2016)
  • Author(s): Ikeda F,Toki T,Kanezaki R,Terui K,Yoshida K,Kanno H,Ohga S,Ohara A,Kojima S,Ogawa S,Ito E
  • Journal Title: Int J Hematol Volume: 103 Pages: 112-114
  • DOI: 10.1007/s12185-015-1891-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ATP11C is a major flippase in human erythrocytes and its defect causes congenital hemolytic anemia (2016)
  • Author(s): Arashiki N, Takakuwa Y, Mohandas N, Hale J, Yoshida K, Ogura H, Utsugisawa T, Ohga S, Miyano S, Ogawa S, Kojima S, Kanno H
  • Journal Title: Haematologica Volume: 101 Pages: 559-565
  • DOI: 10.3324/haematol.2016
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Generation and Fanctional Analysis of Congenital Dyserythropoietic Anemia(CDA) Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells (2016)
  • Author(s): Hiroshi Kohara, Hiromi Ogura, Takako Aoki, Chika Sakamoto, Yoshie Ogawa, Shohei Miyamoto, Hitoshi Kanno, Kenzaburo Tani
  • Organizer: American Society of Hematology, 58th Annual Meeting ＆Exposition
  • Place of Presentation: San Diego（America)
  • Year and Date: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The Novel missense Mutation of GATA1 Caused red Cell Adenosine Deaminase Overproduction Associated with Congenital Hemolytic Anemia (2016)
  • Author(s): Taiju Utsugisawa, Hiromi Ogura,Toshiyuki Yamamoto,Takako Aoki,Takuya Iwasaki,Yumiko Ondo,Takahiro Kawakami, Shinichiro Nakagawa, Shuichi Ozono, Hiroko Inada, Hitoshi Kanno
  • Organizer: American Society of Hematology, 58th Annual Meeting ＆Exposition
  • Place of Presentation: San Diego（America)
  • Year and Date: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 先天性溶血性貧血の診断におけるターゲットシークエンシングの有用性 (2016)
  • Author(s): 岩﨑 拓也、山本 俊至、村松 秀城、奥野友介、佐藤 裕子、三井 哲夫、小野田 正志、矢野 未央、小松 博史、坂本 謙一、青木 貴子、岡本 好雄、槍澤 大樹、小倉浩美、小島 勢二、菅野 仁
  • Organizer: 第78回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県）
  • Year and Date: 2016-10-14 – 2016-10-14
• [Presentation] Next generation sequencing in diagnosis of congenital hemolytic anemia. (2016)
  • Author(s): Kanno H, Utsugisawa T, Ogura H
  • Organizer: The 5th TSH International Symposium, Red Cell Disorders.: From Bench to Bedside
  • Place of Presentation: Bangkok, Thailand
  • Year and Date: 2016-05-21
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] HbA1cが偽性低値を示したエノラーゼ異常症の1例 (2016)
  • Author(s): 井島 廣子, 古賀 正史, 中村 倫子, 松下 文美, 坂本 英美, 岩崎 剛, 松本 理恵, 陣内 冨男, 梶原 敬三, 稗島 州雄, 杉山 正悟, 小倉 浩美, 菅野 仁, 陣内 秀昭
  • Organizer: 第59回日本糖尿病学会年次学術集会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都）
  • Year and Date: 2016-05-20 – 2016-05-20
• [Presentation] Congenital hemolytic anemia due to red cell enzymopathies. (2016)
  • Author(s): Kanno H, Utsugisawa T, Ogura H
  • Organizer: The 5th TSH International Symposium, Red Cell Disorders.: From Bench to Bedside
  • Place of Presentation: Bangkok, Thailand
  • Year and Date: 2016-05-20
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] MedicalPractic 【貧血 実地医家に役立つ知識と診療の進めかた】 セミナー臨床に役立つ知識と情報 溶血性貧血の鑑別診断の進め方 (2016)
  • Author(s): 小倉浩美, 菅野 仁
  • Total Pages: 166
  • Publisher: 文光堂
• [Book] 血液内科 【貧血性疾患診療の進歩】 先天性溶血性貧血の遺伝子診断 (2016)
  • Author(s): 大賀 正一, 山城 安啓, 菅野 仁
  • Total Pages: 273
  • Publisher: 科学評論社
• [Book] 小児内科 【血球の増加と減少】赤血球 貧血 遺伝性貧血 (2016)
  • Author(s): 小倉浩美、菅野 仁
  • Total Pages: 140
  • Publisher: 東京医学社
• [Book] 見過ごせないウイルス感染症ヒトパルボウイルスB19 (2016)
  • Author(s): 大賀 正一,猪股 裕紀洋,菅野 仁,田村 正徳,八重樫 伸生
  • Total Pages: 180
  • Publisher: メディカルレビュー社