エピジェネティクスによる薬剤耐性機序におけるp38αの関与の研究

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10044
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 浅野 健 日本医科大学, 医学部, 教授 (70277490)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤田 敦士 日本医科大学, 医学部, 助教 (50366704) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: p38 / 薬剤耐性 / エピジェネティクス

Outline of Annual Research Achievements

MX2（脂溶性ドキソルビシン）耐性株（BALL, K562）、ドキソルビシン耐性株、クロファラビン耐性株、ネララビン耐性株、ベンダムスチン耐性株、メソトレキサート耐性株、エトポシド耐性株,ビンクリスチン耐性株を用いて薬剤耐性白血病におけるp38α の発現変化、メチル化の変化の検討を引き続きおこなった。①白血病細胞の親株（薬剤感受性株）と薬剤耐性細胞のp38α の状態（mRNA, 蛋白発現、リン酸化蛋白の発現）をwestern blot法、フローサイトメーターで測定を行った。さらに増幅したp38αに対してsiRNAなどを用いた阻害実験を行った。親株に比して耐性株ではp38αの蛋白発現は上昇していた。しかし、mRNAの増加率との違いが大きく、その検定を数回以上おこなっていた。阻害実験ではp38αの発現はmRNA, 蛋白発現とも抑えることができた。②p38α遺伝子のプロモーター領域のメチル化を薬剤感受性細胞と薬剤耐性細胞とで検討する。前年度と同様に薬剤感受性とプロモーター領域のメチル化の程度は細胞株により異なり、耐性株でもほとんどの細胞株は感受性株と耐性細胞株とで同じメチル化の変化を示していた。結論的にはp38αの遺伝子発現の変化はメチル化の変化によるものは考えにくいとなった。③p38α の上流、下流に存在し、cascade 解析で関係が深いと考えられる分子群の発現変化、機能変化、メチル化の変化の検討：p38α 上流に位置するMAPKK としてTAB1, Cdc25B, MKK3, MKK6 MKP-7, 下流に位置する基質としてp73,SAP-1, MIFT, MAPKAPK3, CKII-α、ATF-2, Myf-6, Caspase 3 に関して解析を行った。メチル化に関して、p38αの発現に関与しているという確定した結果を得ることができていない。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

1) p38α遺伝子のプロモーター領域のヒストンアセチル化を薬剤感受性細胞と薬剤耐性細胞とで検討する：抗アセチル化H3, H4抗体と細胞破砕液を反応・沈降させ、抗体を結合したDNAを用いてp38αのプロモーター領域に設計したプライマーを用いてリアルタイムPCR法を行い、定量的に結合したDNA量を測定する。
2) p38αの上流、下流に存在し、cascade解析で関係が深いと考えられる分子群の発現変化、機能変化に関してヒストンアセチルによる影響の検討：p38α上流に位置するMAPKKとしてTAB1, Cdc25B, MKK3,下流に位置する基質としてp73,SAP-1, MIFT, MAPKAPK3, CKII-α、ATF-2, Myf-6, Caspase 3に関してヒストンアセチル化を検討を行う。
3) p38の増幅・抑制による関連遺伝子発現の変化と細胞のphenotypeの変化の検討
①遺伝子発現増幅：p38α cDNAを発現誘導ベクターに組み込み、transfectionを行い、p38α自身, 上流、下流の分子群（特にcascade解析で強く関係しているとされる遺伝子群）、DNMT3Aおよび、MK2、それに関連したCdk25, MK3, MK5のmRNA発現、蛋白発現（リン酸化も含む）、薬剤感受性の変化を検討する。検討する。うまくいかない場合は既に報告のあるMKK6遺伝子による強制発現実験を行う。
②遺伝子発現抑制：p38αの機能を抑制させる薬剤(SB203580, SB 202190) 、siRNA（３種類の候補siRNA, negative control, GAPDHに対するsiRNA(positive control)を用いて遺伝子発現を強制的に抑制させ、DNMT3Aおよび、MK2、それに関連したCdk25, MK3, MK5の発現変化を検討する。

Strategy for Future Research Activity

今年度は最終年度として各方面にコンサルテーションを行うことで現在、stuckしている個所の突破を図り、最終的な目標に向かって進むことを計画している。医局の人員は同じであるが、なんとか時間を作れる見通しが立ったので実験を行う予定である。

Causes of Carryover

医局員の急な退職により病院業務の比重が多くなり満足な時間も取れず、また実験上重要な蛋白解析の部分でstuckしてしまい、その点を突破することができず、予算遂行、実験完遂ができなかった。