2017 Fiscal Year Research-status Report
インフルエンザウイルスの自己・非自己区別とその応用による新薬開発
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16K10047
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
柏木 孝仁 久留米大学, 医学部, 准教授 (70320158)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原 好勇 久留米大学, 医学部, 准教授 (40309753)
渡邊 浩 久留米大学, 医学部, 教授 (90295080)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | インフルエンザウイルス / ポリメラーゼ / Small RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インフルエンザウイルスはRNAを遺伝子として持ち、この遺伝子はインフルエンザウイルス独自のRNAポリメラーゼによって複製され、また転写されている。独自のRNAポリメラーゼを所有することから、抗インフルエンザウイルス薬のターゲットとして注目されている。最近、このRNAポリメラーゼをターゲットとした薬剤が２剤開発された。１つは、ファビピラビルでRNA合成を阻害する。さらに１つはバロキサビルで、インフルエンザウイルスのエンドヌクレアーゼ活性を阻害する。このエンドヌクレアーゼ活性の中心タンパク質がRNAポリメラーゼを構成するPAサブユニットである。我々は、このPAサブユニットの小断片に独自の阻害活性を見つけ、この阻害効果はインフルエンザウイルス自身のRNAポリメラーゼの発現そのものを阻害している事を見出した。そこで、我々はこの阻害活性のメカニズムを探求するためにPA小断片の高発現系を構築し、高純度な生成が行えるかの検討を行った。これまでに、大腸菌を用いたPA小断片の高発現系を構築し、Hisタグ精製によってある程度の精製を行うことが可能となっている。この生成物を用いて、PAのエンドヌクレアーゼ活性と阻害効果の関係を検討したところ、強い相関がみられ、PAの小断片によるRNAポリメラーゼの阻害効果には小断片のエンドヌクレアーゼ活性が関与していることが示唆されていたが、さらにメカニズムを精査するだけの十分な高純度の小断片を大腸菌を用いた発現系では得ることができていなかった。そこで、これまでに多くの実績があるバキュロウイルスの発現系に切り替えて小断片の高発現系と高純度精製系の構築を目指すとともに、阻害効果にエンドヌクレアーゼ活性の関与が強く示唆されることから、ターゲットとなりうるRNA核酸の探索を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
PAの小断片によるインフルエンザウイルスRNAポリメラーゼの発現抑制にエンドヌクレアーゼが関与している可能性は疑いようがないが、どのようにこの活性がインフルエンザウイルス自身のRNAポリメラーゼの発現抑制に関わっているのか不明な点が多い。この発現抑制メカニズムを解明するために、細胞内の様々な調整に関わっている宿主細胞内のSmall RNAに着目して、PA小断片の存在下でSmall RNAの量的・質的変化を観察した。しかしながらSmall RNAの量的および質的分布に変化が見られなかった。さらなる別の核酸がターゲットとなっている事が示唆され、未だに阻害メカニズムの全容解明には至っていない。
PA断片の高発現、高純度の精製系については、大腸菌からバキュロウイルスへと変更し、Wildtypeに加えMutant断片の精製を試みたところ、Mutant断片については、大腸菌の発現よりも高発現、高純度の断片を得ることができた。一方でWildtypeの小断片については、大腸菌の発現系に劣っており、期待するだけの生成物を得るに至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
PA小断片のエンドヌクレアーゼを介したインフルエンザウイルス自身のRNAポリメラーゼタンパク質の発現抑制メカニズムの過程で、ターゲットとなりうる核酸の想定に含まれていなかったSmall RNAに着目して解析を行ったが影響が確認できず、さらに別のターゲットを考える必要がある。インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼ発現に特異的に作用していることから、インフルエンザウイルスのmRNAに特異的な構造が関与している可能性が考えられる。Cap構造やPolyA構造はインフルエンザウイルスと宿主のmRNAで違いはないが、インフルエンザウイルスのRNAには5端末と3端末に特異的なPromoter配列が存在している。そこで、今後はこのインフルエンザウイルスの特異配列に着目してPA小断片による阻害メカニズムの解明を進める。
一方で、バキュロウイルスを用いた高発現・高純度なPA小断片の発現・精製系については、エンドヌクレアーゼ活性を喪失したMutant断片では構築できたが、Wildtype断片では十分な発現が確認できていない。PA小断片の持つエンドヌクレアーゼ活性が発現を妨げている可能性がある。そこで、今後はPA小断片のエンドヌクレアーゼ活性を阻害しながらの発現・精製が可能か検討を行う。例えば、近年開発されたエンドヌクレアーゼ阻害薬であるバロキサビルの利用などを検討している。
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| Causes of Carryover |
今年度の使用額は想定された物品費の額よりやや高額であったが、前年度の繰越金があったために再度次年度使用額が生じた。
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Research Products
(7 results)
