2016 Fiscal Year Research-status Report
川崎病におけるエクソソームmicroRNAの研究：新たな診断法、治療に向けて
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16K10079
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
大橋 隆治 日本医科大学, 医学部, 准教授 (00328783)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
深澤 隆治 日本医科大学, 医学部, 准教授 (80277566)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 川崎病 / 血管炎 / miRNA / エクソソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
① 分担研究者の深澤が以前作成したCandida albicans water soluble -induced (CAWS) 血管炎マウスモデル、およびコントロール群の心臓のパラフィン固定標本を各５匹分づつ使用し、各種炎症細胞（リンパ球、好中球、組織球）の動態について、形態学的解析を施行した。
②HE染色にて、リンパ球、好中球などの炎症細胞とともに多数の組織球浸潤も観察された。さらに、CD68 免疫染色で、これらの組織球浸潤程度を評価した。また、エクソソームに関連する蛋白の発現を同定するため、各種免疫染色を試みた。
③以前作成した、CAWSモデルマウスの保存血清から、超遠沈を行い、エクソソーム分画とそれ以外の分画を行った。エクソソームは、電顕にて形態的な同定を行った。
④マウス血清中のエクソソーム分画とそれ以外の分画からそれぞれmiRNAの抽出を試みた。各マウス１匹ごとに、抽出しようとしたが、十分な量のmiRNAが得られなかった。そのため、５匹を１つの検体として、コントロール群と血管炎活動期群からmiRNA抽出を行い、miRNA Ready-to-Use PCR,Mouse&Rat panel I+II(Exiqon)を用いてReal time-PCRに基づくmiRNAの網羅的解析を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
①免疫染色における抗体の濃度、設定条件など、様々な条件を色々試したが、納得できる結果が得られず、かなりの時間を要した。
②マウス血清中のエクソソーム由来のmiRNAは極めて微量なため、検出に苦労した。Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて、品質検定を行ったが、評価に値する質、量が得られず、同実験を数回繰り返した
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| Strategy for Future Research Activity |
①新たにCAWSモデルマウスを作製し、組織、尿からmiRNAを抽出し、血清と同様にmiRNAの網羅的解析を行う。血清中のエクソソーム分画とそれ以外、心組織、尿を比較し、血管炎発症に関わるmiRNAの同定を行う。
②同定されたmiRNAについて、CAWSモデルマウス惹起後の変化の確認を行う。
③同定されたmiRNAの心組織の局在をみるため、in situ hybridizationを行う
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| Causes of Carryover |
血清からのエクソソーム分画とそれ以外の分画からのmiRNAが微量で品質検定に手間取り、網羅的解析を行う予定であった心組織、尿からのmiRNAの検出までに至らなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新たなCAWSモデルマウスの作製、心臓、血清、尿検体を用いた、より高品質なmiRNAの摘出。エクソソーム分画とそれ以外のmiRNAと炎症活動期のmiRNAの網羅的解析などに使用する予定である。
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