2017 Fiscal Year Research-status Report

興奮毒性による分子シャペロンVCP酸化損傷の意義およびHIE治療戦略への応用

Research Project

Project/Area Number	16K10112
Research Institution	Suzuka University of Medical Science
Principal Investigator	古川絢子鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助教 (10455537)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	郡山恵樹鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 准教授 (70397199)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	興奮毒性 / 神経細胞死 / 酸化ストレス / VCP / 活性化アストロサイト
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、興奮毒性による神経細胞死において、シャペロンタンパク質であるvalosin containing protein (VCP) の役割を明らかにすることである。VCPの酸化損傷が小胞体ストレスを介して神経細胞死を惹起するという仮説を検証し、VCPが興奮毒性による細胞死の治療標的分子となり得るかを検討する。昨年度の研究結果から、VCPは活性化したアストロサイトに強く発現することが明らかになった。本年度は、グリア細胞の培養系を用いて、興奮毒性や酸化ストレスがVCPの発現に影響を及ぼすかを検討した。ラット胎仔の大脳皮質を取り出し、10%血清存在下で培養したmixed glial cultureを実験に使用した。興奮毒性試薬としてグルタミン酸を、酸化ストレスとして過酸化水素を使用して細胞生存率を検討した。グルタミン酸は20mMから生存率の低下が認められ、200mMでは、ほとんどが細胞死を引き起こした。過酸化水素は0.3mMから生存率の低下が認められ、0.7mMでは、ほとんどが細胞死を引き起こした。これらの条件でウェスタンブロットを行い、VCPの発現量に変動が見られるかを検討したが、VCPの発現変動は認められなかった。顕微鏡での形態的な観察においても、活性化アストロサイトのような形態が認められないことから、培養系でのアストロサイトの活性化が再現できていないと考えられた。そのため、新たな実験系としてVCPの阻害剤と興奮毒性試薬を組み合わせることを検討している。また、興奮毒性試薬を投与したラットの海馬においては、グリア細胞の活性化とVCPの発現増加が認められることから、投与後３時間から７日までの標本を準備し、VCP発現変動の経時変化を検討する準備を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、培養細胞系を用いて、興奮毒性によるグリア細胞における機能変化とVCPの役割を解析する予定であったが、培養アストロサイトの活性化条件が決定できなかった。そのため、他の実験方法を検討する必要があった。培養細胞にVCPの阻害剤を用いて、VCPの機能を阻害した状態で興奮毒性試薬を負荷し、VCPの役割や細胞死との関連を検討したいと考えている。また、興奮毒性を負荷したラットにおいて、VCP発現の増減や局在の変化を経時的に解析する準備を進めている。これまでに、興奮毒性試薬であるカイニン酸を投与後72時間（海馬錐体細胞層の細胞死が認められる時間）において、アストロサイトに発現が増加することを認めている。海馬錐体細胞層の細胞死が認められる前後において、VCPの局在や発現が変化するかどうか確認する予定である。以上のように、当初の実験計画から変更が必要になっているが、他の案を準備しており、概ね順調に進んでいると考える。
Strategy for Future Research Activity	平成30年度は、興奮毒性試薬であるカイニン酸を投与したラットを用いて経時的（投与後３時間、２４時間、７２時間、７日間）に脳切片を作製し、VCPの免疫染色を行う。カイニン酸投与後の海馬において、錐体細胞層の細胞死やグリア細胞の活性化などの経時的なイベントとともに、VCPの発現強度や局在の変化が認められるか検討する。神経細胞（マウス海馬神経細胞由来HT-22あるいは海馬神経細胞の初代培養）やグリア細胞（C6ラットグリオーマ細胞や大脳皮質の初代培養によるmixed glial culture）の培養系を用いて、VCPの阻害剤と興奮毒性試薬を組み合わせた実験を行い、VCPの細胞内での役割を解明する。MTT assayやTUNEL染色にて細胞死を評価し、活性酸素生成量や、生体高分子への酸化損傷を、細胞染色やウェスタンブロット法を用いて定量評価する。小胞体ストレスマーカーのウェスタンブロットを行い、VCPの機能阻害による細胞死における小胞体ストレスの関与を検討する。抗酸化剤やケミカルシャペロンの併用により細胞死が抑制できるか検討し、VCPのシャペロン機能代償による細胞死抑制効果を検討する。
Causes of Carryover	生じた差額は僅かであり、ほぼ計画通りに執行した。差額は、次年度の消耗品や試薬の購入に充てる。