2016 Fiscal Year Research-status Report

胎盤細胞で働くエンドソーム膜タンパク質MLN64のコレステロール輸送における役割

Research Project

Project/Area Number	16K10113
Research Institution	Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
Principal Investigator	奈良篤樹長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 准教授 (60387959)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	オルガネラ接触 / MLN64 / エンドソーム / 胎盤細胞
Outline of Annual Research Achievements	ヒト胎盤細胞のミトコンドリアで大量に産生されるプロゲステロンは、妊娠維持に働く極めて重要なステロイドホルモンである。プロゲステロンを大量に産生するには、その原料となるコレステロールを大規模かつ効率よくミトコンドリアへ輸送する必要があるものの、その輸送分子機構についてほとんど分かっていない。研究代表者は、胎盤細胞においてエンドソームとミトコンドリアが接触することを発見した。このエンドソームに存在するコレステロール結合タンパク質MLN64を欠くとプロゲステロンを産生できないことから、本研究では、胎盤細胞におけるエンドソーム-ミトコンドリア間の接触による新規コレステロール輸送の分子機構解明を目指し，下記研究結果を得た。 (1)強制的に後期エンドソームとミトコンドリアを接触させるコンストラクトを構築し，発現誘導に成功した。免疫染色等の方法を用いた細胞生物学的手法により，発現タンパク質が後期エンドソームとミトコンドリアの近傍に存在し，小胞体やゴルジ体とは異なる区画に存在することもわかった。 (2)リン酸化が示唆されるMLN64アミノ酸点変異コンストラクト構築に着手した。リン酸化が示唆される４箇所のセリン残基の全ての点変異コンストラクトのうち，８種類の変異体構築をシーケンス解析により確認し完了した。これら変異体を細胞に発現させると，初期エンドソーム様の特異な区画に局在することも判明し，どの様な特徴を持つ区画なのかについても解析を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 年度内に計画予定であった3D電顕解析が電顕のカメラ故障により画像取得できず，修理に時間がかかっていることが理由である。今年度７月に修理し部品交換を予定している。そのため，次年度以降行う予定であった研究計画を前倒しで行った。
Strategy for Future Research Activity	(1)強制的に後期エンドソームとミトコンドリアを接触させるコンストラクトを用いた解析，及び(2)リン酸化が示唆されるMLN64アミノ酸点変異の解析を引き続き行う。具体的には，(1)については発現させた時のコレステロール量やステロイドホルモン産生量の測定を行い，オルガネラ接触におけるステロイドホルモン産生の詳細を明らかにする。(2)全ての点変異体作製を完了し，変異体の局在やコレステロール分布やその取り込み，ステロイドホルモン産生量の測定を行う予定であり，コレステロール輸送や感知の分子機構を明らかにする。さらに，電子顕微鏡の修理が完了後，3D電顕を行い，オルガネラ接触の微細構造を明らかにする。
Causes of Carryover	今年度予定していた電子顕微鏡解析を次年度以降に実施することとなり，電顕に要する費用を次年度に使用することとしたため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	電子顕微鏡観察やサンプル調製に必要な試薬や器具等に費用を充てる方針である。