2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K10170
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
深井 和吉 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20244642)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
國本 浩之 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (80372853)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | チロシナーゼ / ケミカルシャペロン / ミスセンス変異 / 白皮症 / 常染色体劣性遺伝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1)ヒトチロシナーゼcDNAにin vitro mutageneisによりR77Q, P431L, H211Y, R239W, D383Nの5種類の日本人OCA1で報告されているチロシナーゼミスセンス変異を導入しました。
2)HeLa細胞に、これらのミスセンス変異導入したチロシナーゼをレンチウイルスによる導入システムにより導入し、それぞれチロシナーゼタンパク質の細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡により観察しました。また、細胞よりタンパクを抽出し、PNGase FおよびEndo Hによる酵素処理ののち、ウェスタンブロットにより解析したところ、野生型およびすべての変異体はPNGase Fに感受性であること、またミスセンス変異体はEndo H感受性であるものの、野生型は非感受性であることがわかりました。
3)共焦点レーザー顕微鏡の観察によって、これらのミスセンス変異チロシナーゼは、すべて小胞体にとどまっており、末梢に到達していない状態、すなわちER retensionをおこしていることが明らかとなりました。とくにH211Yは一部に特異な分布を示しており、その一部は、シスゴルジ装置まで移動しているものの、さらに末梢には到達していなかった。
4)これらのミスセンス変異を導入したHeLa細胞に、チロシナーゼインヒビターの一つであるデオキシアルブチンを投与して、チロシナーゼ活性を測定したところP431Lの変異体において、dose dependentなチロシナーゼ活性の復活が観察された。20マイクロモルの濃度でこの化合物を添加した場合、野生型チロシナーゼのおよそ18％程度の酵素活性の復活が観察された。一方、R77Q, H211Y, R239Wの変異株では、このようなケミカルシャペロン効果はみとめられなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
上記の４）については29年度に施行する予定であったところ、28年度にほぼ完成できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、このシステムを用いて、より効率のよい化合物はないか、さらにより多くの変異でケミカルシャペロン効果が期待される化合物はないのかについて、検討していく予定。さらにはvivoでも同様の効果がみられるかどうかについて、ゲノム編集によりP431Lミスセンス変異に相当する、白皮症マウスモデルを作成し、このマウスでのケミカルシャペロン効果が期待されるかどうかについても検討していく予定である。
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| Causes of Carryover |
細胞培養の消耗品使用が予定より少量ですませたこと
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新しい、ケミカルシャペロン候補薬剤のスクリーニングに使用
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