2016 Fiscal Year Research-status Report
シナプスプルーニング仮説に基づくiPS細胞由来神経培養系での統合失調症病態解明
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16K10191
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
鳥塚 通弘 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (20588529)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
芳野 浩樹 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (10347560)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 統合失調症 / iPS細胞 / シナプス / 補体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
奈良県立医科大学精神科に通院・入院中の統合失調症患者11名、および本研究に賛同を得た健常対照者12名から、書面にて研究参加の同意を得た。全例の上腕内側部のパンチバイオプシーから得られた皮膚線維芽細胞を培養し保存した。このうち8名の検体からエピソーマルプラスミドベクターを用いた方法（Okita K. et al., Nat Methods., 8(5):409-12、2011）でiPS細胞を樹立し、保存した。
我々の細胞培養系でiPS細胞から分化誘導される神経細胞は、そのほとんどがvGlut1陽性で大脳皮質のLayer marker陽性の、大脳皮質の錐体細胞と同等の細胞である。これまでに、この培養神経細胞においてシナプス前蛋白であるSynapsin1の発現をqRT-PCRで認め、免疫染色法ではSynaptophysinと興奮性のシナプス後蛋白であるPSD95の発現を認め、一部は重なり合いシナプスを形成していると考えられた。パッチクランプ法を用いた電気生理学的解析を行うと、活動電位を生じる機能的な神経であることが確認でき、さらには、自発性シナプス後電流（Post synaptic current）も記録され、シナプスの形成が機能的にも確認できた。
次に、健常対照者1名の培養神経細胞を用いて、補体および補体制御因子の発現をqRT-PCR法にて調べたところ、継時的な発現上昇を認めた。これは、シナプス蛋白の継時的な発現変化と相関していると考えられ、シナプス形成の進展に伴って発現量が増加していると考えられた。この神経細胞を、市販のマウス由来ミクログリア細胞株と共培養を行ったところ、ヒト神経細胞と同様の培養条件でミクログリア細胞株は共培養可能であることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒトiPS細胞由来神経細胞の培養実験系に関しては、安定して確立できた。また、同培養系において、本研究のターゲットとなる補体および補体制御因子の発現についても確認できた。次に、マウス由来細胞株ではあるが、ミクログリアと神経細胞との共培養が可能であることも確認できた。以上の様に、本研究遂行の前提となる培養実験系については、おおむね確立できたと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
共培養下におけるシナプス動態の観察は今後行う予定である。次に、補体制御因子のノックダウンベクターについては、ベクター作製に必要なコンストラクトは手に入れており、条件設定中である。神経細胞への導入について、力価の面でまだ不足があるため、今後手法を再検討して十分な条件を探る。生体マウス由来のミクログリア細胞の分離・培養については、予備実験は済んでおり、神経細胞との共培養を試みていく。
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