2016 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集による自閉症モデルiPS細胞の作製と解析
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16K10202
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| Research Institution | Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center |
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Principal Investigator |
中山 敦雄 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 発生障害学部, 部長 (50227964)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松木 亨 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 発生障害学部, 主任研究員 (90332329)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / iPS細胞 / ニューロリギン４ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成２８年度の実施計画 ①ゲノム編集用コンストラクトの構築、②ゲノム編集用コンストラクトの導入、③適切なクローンの選択、④移植系での神経細胞分化誘導予備実験、のうち、①および②の途中段階までの実施に留まった。①についてはまずNLGN4Xノックアウトのために３箇所の異なるgRNA配列を導入したCRISPER/Cas9ベクターを作製した。gRNA部位は定法に従い、NLGN4X遺伝子の第二エクソン上の翻訳開始点近傍に設定した。さらにCRISPER/Cas9活性評価のためのEGFP系レポーターコンストラクトを作製した。これらをまずはHeLa細胞に導入し、いずれも細胞内で十分に標的部位でのヌクレアーゼ活性を示すことを確認した。当初の計画では最初から患者型変異を導入するノックイン実験を行うためにターゲッティングベクターの作製も平行して進める予定であったが、ヒトiPS細胞での目的に適ったノックイン効率が必ずしも高くない状況であるという認識から、まずは確実なノックアウト技術の確立を優先し、ノックイン実験は次年度に進めることとした。
②のノックアウトコンストラクトの導入は、当初導入を予定していたiPS-TIG114系統細胞を含む男性由来iPS細胞が、理研細胞バンクからの提供体制に乗せられていなかったために実施が遅れている。このため上記の様に予備実験としてのHeLa細胞への導入のみを完了した。昨年度中に提供細胞として男性由来iPS細胞が新たに追加されて来たため、これを入手しての導入実験は現在進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究実績の概要に記載のとおり、ゲノム編集自体を研究室に新たに導入したために、その進行に関しての研究計画はやや甘い見積もりであった。必要な実験材料を揃えることを含めて、慎重に検討しての研究遂行の結果、当初計画より遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題の研究計画は３年間で段階的に進める一連の実験を進めるものである。このため平成２８年度に行えなかった実験を進めて、引き続きただちに平成２９年度の研究計画を行うことである程度の遅れを挽回できるものと考えている。平成２９年度は作製したゲノム編集iPS細胞の①培養系での解析と②マウス子宮内胎仔脳への移植系での解析、予定しているが、②は現在新しい実験手法として所属研究所での実施体制を確立中であることから、平成３０年度実施に変更する可能性がある。
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| Causes of Carryover |
研究実施概要で記載したとおり、当初予定よりも実験の実施が遅れていることにより、当初見積もった平成２８年度での支出を平成２９年度に繰り越して使用する必要が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は主に実験のための消耗物品費であり、平成２８年度分の実験を次年度前半に実施することにより予定どおり使用していく。
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[Journal Article] Characterisation of novel RUNX2 mutation with alanine tract expansion from Japanese cleidocranial dysplasia patient.2016
Author(s)
Shibata A., Machida J., Yamaguchi S., Kimura M., Tatematsu T., Miyachi H, Matsushita M., Kitoh H., Ishiguro N., Nakayama A., Higashi Y., Shimozato K., Tokita Y.
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Journal Title
Mutagenesis
Volume: 31
Pages: 61-67
DOI
Peer Reviewed / Open Access
