糖鎖発現解析による腎移植後慢性拒絶反応の新規診断法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10420
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 高野 恵輔 筑波大学, 医学医療系, 研究員 (70615038)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 腎移植 / リンパ球 / レクチン / 抗体関連型拒絶反応 / 糖鎖 / マイクロアレイ

Outline of Annual Research Achievements

本研究は腎移植患者のリンパ球表面の糖鎖発現解析を行い、全く新しい拒絶反応を予測する糖鎖バイオマーカーを同定し、さらに拒絶反応の治療への応用を検討することを目的とする。これまでの実験の概要は1. 腎移植患者の末梢血リンパ球単離 2. 高密度レクチンマイクロアレイを用いた網羅的な移植前後における1.で分離したリンパ球の糖鎖修飾解析を行うことである。
腎移植後患者をGroup1 (腎移植前)、Group2 (腎移植後、腎機能安定)、Group 3 (腎移植後、腎機能安定、腎生検で慢性活動性抗体関連型拒絶なし)、Group 4 (腎移植後、腎機能悪化、慢性活動性抗体関連型拒絶あり)に分類することに決めた。当院で平成28年度に行われた腎移植レシピエントは15名おり、それぞれのレシピエントに対し腎移植前の血液サンプルをGroup1として収集した。現時点では1例を除き全例、術後腎機能は安定していることからGroup2に相当している。また、腎機能悪化などで、移植後生検を行った症例は1例あり、その時の組織標本を保存している。この症例はヘマトキシリン・エオジン染色およびC4d染色において明らかな慢性活動性抗体関連型拒絶は認められず、腎機能悪化、慢性活動性抗体関連型拒絶なしの群に相当し、新たにGroup 6として追加した。産総研の協力の下、産総研が独自に開発した96 種類のレクチンで糖鎖全体の約80%を網羅的に解析可能な高密度レクチンマイクロアレイを用いて網羅的な糖鎖修飾解析を行うことを予定しているが、本年度はその準備として、高密度レクチンマイクロアレイの精度確認を行った。高密度レクチンマイクロアレイで得られたデータはデータマイニングソフトウェアであるGeneSpringを用いて解析し、そのGeneSpringsは筑波大学磯田研究室のものを使用することになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

腎移植後患者をGroup1 (腎移植前)、Group2 (腎移植後、腎機能安定)、Group 3 (腎移植後、腎機能安定、腎生検で慢性活動性抗体関連型拒絶なし)、Group 4 (腎移植後、腎機能悪化、慢性活動性抗体関連型拒絶あり)に分類することに決めた。当院で平成28年度に行われた腎移植レシピエントは15名おり、それぞれのレシピエントに対し腎移植前の血液サンプルをGroup1として収集した。現時点では1例を除き全例、術後腎機能は安定していることからGroup2に相当している。また、腎機能悪化などで、移植後生検を行った症例は1例あり、その時の組織標本を保存している。この症例はヘマトキシリン・エオジン染色およびC4d染色において明らかな慢性活動性抗体関連型拒絶は認められず、腎機能悪化、慢性活動性抗体関連型拒絶なしの群に相当し、新たにGroup 6として追加した。産総研の協力の下、産総研が独自に開発した96 種類のレクチンで糖鎖全体の約80%を網羅的に解析可能な高密度レクチンマイクロアレイを用いて網羅的な糖鎖修飾解析を行うことを予定しているが、本年度はその準備として、高密度レクチンマイクロアレイの精度確認を行った。高密度レクチンマイクロアレイで得られたデータはデータマイニングソフトウェアであるGeneSpringを用いて解析し、そのGeneSpringsは筑波大学磯田研究室のものを使用することになった。

Strategy for Future Research Activity

Group 1、Group 2、およびGroup 6のサンプルを高密度レクチンマイクロアレイを用いて網羅的な糖鎖修飾解析を行うことを予定している。この結果を筑波大学磯田研究室にGeneSpringを用いて解析する予定である。レクチン染色に関しては96 種類それぞれ確立された染色法はなく、我々が先行研究で行っている手法に基づいて統一して行い、評価する予定である。現時点ではまだ1例であるため、サンプルがもう数例集まった段階で免疫染色を行いたいと考えている。高密度レクチンマイクロアレイで明らかになった糖鎖修飾の発現プロファイリングからスクリーニング診断および拒絶反応ハイリスク診断に有用と思われるレクチンを数個に厳選する。これらレクチンの組み合わせたマイクロチップを作成し、スクリーニング検査を確立することを目指す。さらに特異的レクチンにより層別化したリンパ球細胞に各種免疫抑制剤の投与を行い、高密度レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖修飾の発現プロファイリングをもとに、拒絶反応に対しての治療効果を検討することを予定している。現時点での問題点として、症例数が少ないために、レクチンマイクロアレイで出てきた結果に対する統計的な有意差をつけることが難しいことが予想される。この問題点を解決するために、他施設の移植希望患者の紹介を要請することで、症例数を増やす。

Causes of Carryover

平成29年度も腎移植を行う予定であり、今後も症例が増える予定である。さらなる患者検体サンプルは採取および保存をする。高密度レクチンマイクロアレイによる本試験およびこの結果得られるデータの解析を筑波大学磯田研究室にGeneSpring®で行い、糖鎖修飾の発現プロファイリングを検討する。高密度レクチンマイクロアレイおよび試薬により追加の費用が発生する。レクチンによる免疫染色およびマイクロチップの作成に費用が発生する。さらに、免疫抑制剤の効果判定を行うにあたり、免疫抑制剤および新たなマイクロアレイの費用が発生する。

Expenditure Plan for Carryover Budget

収集したサンプルを高密度レクチンマイクロアレイを用いて網羅的な糖鎖修飾解析を行うことを計画している。この結果をGeneSpringを用いて解析する計画である。レクチン染色に関しては我々が先行研究で行っている手法に基づいて統一して行い、評価する計画である。高密度レクチンマイクロアレイで明らかになった糖鎖修飾の発現プロファイリングからスクリーニング診断および拒絶反応ハイリスク診断に有用と思われるレクチンを数個に厳選する。これらレクチンの組み合わせたマイクロチップを作成し、スクリーニング検査を確立することを目指す。さらに特異的レクチンにより層別化したリンパ球細胞に各種免疫抑制剤の投与を行い、高密度レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖修飾の発現プロファイリングをもとに、拒絶反応に対しての治療効果を検討することを計画している。