2016 Fiscal Year Research-status Report
ホルマリン固定組織へ応用可能な多重遺伝子発現解析に基づく乳癌の再発予測法の開発
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16K10456
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
直居 靖人 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (30646211)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 乳癌 / マイクロアレイ / 再発予測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究実績の概要
乳癌の再発予測法の開発は、術後補助化学療法の適応を決定する上で臨床現場のニーズが高く近年欧米では多重遺伝子診断法が開発され臨床応用されている。我々はマイクロアレイを用いた再発予測法「Curebest 95GC」を開発し2013年に実用化した。しかしながら本法では生検体：RNAlater浸透組織や凍結乳癌組織（-80℃）を必要とするためその保存の煩雑さが普及の妨げとなっている。そこで、本研究の目的は、Curebest 95GCをホルマリン固定パラフィン包埋組織検体（以下、FFPE検体）にも応用可能なように改良することである。本年度は以下の検討を行った。
①FFPE検体からのRNA抽出条件の最適化
ホルマリン濃度や浸透時間の調整等によってFFPE自体の制作過程を見直し、更に薄切切片の厚みによる脱パラフィンの条件や、検体破砕方式、カラム抽出時の試薬選択や反応時間等を検討し、FFPE専用に最適化した遺伝子抽出プロトコールを改善し、FFPE検体からRNAを崩壊少なく抽出できる手法を確立した。また遺伝子をより効率よく増幅し得るランダムプライマーの選定を行った。
②FFPE検体由来の変性したRNAからの予測モデルの作成
Curebest 95GCに使用する数十～数百個程度の遺伝子群の中から、より多くの凍結検体/FFPE検体ペアを互いに比較して、FFPE検体においてRNAが崩壊しやすい遺伝子群を同定し、それらを引いた残りの遺伝子群を用いて改良・再構築を行い、新たにFFPE検体専用の各種多重遺伝子診断法を作成することを試みた。詳細な検討の結果、Curebest 95GCに関しては、崩壊しやすい遺伝子群を引く必要性に乏しく、95個全ての遺伝子群を用いてFFPE検体用の予測モデルを作成することにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
理由
本研究計画では、主に下記の5項目を予定している。
①FFPE検体からのRNA抽出条件の最適化、②FFPE検体由来の変性したRNAからの予測モデルの作成、③生物情報学（Bioinformatics）における検討、④FFPE検体専用のマイクロアレイデータ正規化法refRMAの構築、⑤FFPE検体用に改良した再発予測法（改良型Curebest 95GC）の検証
このうち、①②の検討をほぼ終えており、おおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策
上記、①～⑤の項目のうち、下記項目を予定している。
③生物情報学（Bioinformatics）における検討：低品質の遺伝子発現データを除去する数学的フィルタリングや、外れ値を検出する主成分分析図法等の研究開発によって、FFPE検体においても凍結検体の予測結果を忠実に再現できるように、Bioinformaticsの面からも調整を試み、独自のQuality control system を確立する。
④FFPE検体専用のマイクロアレイデータ正規化法refRMAの構築：データ正規化法refRMAとは、学習用コホートで予め計算した全ての「係数」をファイルとして保存し（refRMAモデル）、学習用コホート以外の新たな１検体にその「係数」をあてはめる手法である。これは新たな1症例を正確に客観的に予測診断する際に必要な計算法である。Simon Katzらの論文（BMC Bioinformatics 2006, 7:464）によると学習用コホートに100～200例、評価用に50例を用いた場合、RMAと相関が0.99以上となるrefRMAモデルを構築できたと報告している。これを踏まえて、FFPE保存検体200例程度の学習用コホートおよび50例程度の評価用コホートで発現マイクロアレイ測定を行い、実用化に向けたFFPE検体用正規化法（refRMA）を確立する。
⑤FFPE検体用に改良した再発予測法（改良型Curebest 95GC）の検証：①～④の検討を経て、FFPE検体用に新たに改良した再発予測法（改良型Curebest 95GC）の臨床的有用性をレトロスぺクティブ研究で検証する。
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Research Products
(2 results)
