癌C5aR、C5a遊離プロテアーゼを標的とした治療法の確立

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10503
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 新田 英利 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (90555749)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石本 崇胤 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 特任講師 (00594889) ; 岩槻 政晃 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (50452777) ; 小澄 敬祐 熊本大学, 医学部附属病院, 非常勤診療医師 (50594884) ; 藏重 淳二 九州大学, 医学研究院, 助教 (90594474)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 補体C5a / C5a受容体 / 肝stellate cell / CAFs / 大腸癌肝転移

Outline of Annual Research Achievements

1.大腸癌細胞株におけるC5aR発現：C5aR抗体を用いてWestern Blot法で大腸癌細胞株におけるC5aRの発現を確認したところ、HCT15、HCT116、colo205でC5aRの発現を認め、DLD7、SW620では発現を認めなかった。
2.肝stellate cell (HSC)におけるC5aRの発現：HSC培養細胞であるLi-90、LX2、ヒト線維細胞であるHS68についてC5aR抗体によるwestern blottingでC5aRの発現を検討したところ、LX2においてC5aRの発現を認めた。
3.C5aによるHSCの活性化：C5aR発現を有するLX2にrecombinant C5a (rC5a)で刺激したところ、時間依存的にαSMAの発現亢進を認めたことから、C5a-C5aRによりHSCの活性化が起こってることが示唆された。
4.大腸癌肝転移症例における活性化HSCの確認：大腸癌肝転移標本からαSMA抗体を用いて免疫染色で活性化HSCを同定したところ、肝転移巣内および周囲にαSMAの発現を認めた。現在複数例の症例で免疫染色を行い、予後との相関、浸潤形式とαSMA発現の相関について統計解析中である。
5.HSCが大腸癌に及ぼす影響：growth assay、invasion assayを用いて現在解析中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

大腸癌細胞株におけるC5aR発現、肝stellate cell (HSC)におけるC5aRの発現の確認に時間を要したため。

Strategy for Future Research Activity

1.肝癌組織からcancer associated fibroblast（CAF）を樹立する。申請者らは以前、胃癌組織23例からGentle MACS Dissociatorを用いてCAFの樹立に成功した。同手法を用いて大腸癌肝転移巣から得た癌組織からCAFを樹立し培養継代する。その後、CAFにおけるC5aRの発現をWestern Blot法、Flow cytometryで確認する。
2.C5a刺激を行ったHSC、CAFが大腸癌細胞株に与える影響をgrowth assay、invasion assayを用いて解析する。具体的には、invasion assay kitの下層にHSC+C5aあるいはCAF+C5aをアプライし、上層にC5aRの発現の無い大腸癌細胞株をアプライする。一定時間反応させたのち、チャンバーの下層に浸潤した細胞をカウントする。さらにHSC、CAFをC5aR antagonistまたはC5aR-siRNAによるknockdownすることで肝細胞癌浸潤抑制効果を確認し、C5a-C5aR特異的なcancer-stromal interactionを確認する。
3.癌－間質細胞のC5aRを介した浸潤・増殖メカニズムについて解析する。癌間質細胞であるHSC、CAFはC5a-C5aRを介して活性化されサイトカインを分泌することで癌細胞増殖・浸潤を促進させている可能性があるため、サイトカインアレイを用いて検討する。C5aで刺激したHCS、CAFのサイトカインアレイ（SDF-1、HGF、CXCL8, CXCL12等）を行い、産生亢進しているサイトカインを解析する。産生が亢進したそれぞれのサイトカインを特異的に阻害した場合の癌細胞の増殖・浸潤抑制効果についてそれぞれgrowth assay、invasion assayを用いて解析する。

Causes of Carryover

大腸癌細胞株におけるC5aR発現、肝stellate cell (HSC)におけるC5aRの発現の確認に時間を要し、当初計画していた検証まで進めなかった。また、医局内保管の試薬等を使用することが出来たため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究費は主に試薬等の消耗品購入費に充てる。また、解析結果の管理、集約や資料整理を行ってもらう事務補佐員の雇用経費に充てたいと考える。

Research Products

• [Journal Article] Pre-treatment double- or triple-positive tumor markers are predictive of a poor outcome for patients undergoing radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma. (2017)
  • Author(s): Nitta H, Nakagawa S, Kaida T, Arima K, Higashi T, Taki K, Okabe H, Hayashi H, Hashimoto D, Chikamoto A, Ishiko T, Beppu T, Baba H
  • Journal Title: Surg Today Volume: 47 Pages: 375-84
  • DOI: 10.1007/s00595-016-1385-6.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Preoperative platelet-to-lymphocyte ratio can predict recurrence beyond the Milan criteria after hepatectomy for patients with hepatocellular carcinoma. (2017)
  • Author(s): Kaida T, Nitta H, Kitano Y, Yamamura K, Arima K, Higashi T, Taki K, Nakagawa S, Okabe H, Hayashi H, Imai K, Hashimoto D, Yamashita Y, Chikamoto A, Ishiko T, Beppu T, Baba H
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 47(10) Pages: 991-999
  • DOI: 10.1111/hepr.12835
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] C5a receptor (CD88) promotes motility and invasiveness of gastric cancer by activating RhoA. (2016)
  • Author(s): 1.Kaida T, Nitta H, Kitano Y, Yamamura K, Arima K, Izumi D, Higashi T, Kurashige J, Imai K, Hayashi H, Iwatsuki M, Ishimoto T, Hashimoto D, Yamashita Y, Chikamoto A, Imamura T, Ishiko T, Beppu T, Baba H
  • Journal Title: Oncotarget Volume: 7(51) Pages: 84798-809
  • DOI: 10.18632/oncotarget.12656
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Degenerative hepatic hemangioma mimicking biliary cystadenocarcinoma. (2016)
  • Author(s): Kaida T, Higashi T, Kitano Y, Yamamura K, Arima K, Taki K, Imai K, Nitta H, Hashimoto D, Chikamoto A, Namimoto T, Nakahara O, Beppu T, Baba H
  • Journal Title: J Gastroenterol Hepatol Volume: 31(8) Pages: 1385
  • DOI: 10.1111/jgh.13325
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Expression of the anaphylatoxin C5a receptor in gastric cancer: implications for vascular invasion and patient outcomes. (2016)
  • Author(s): Nitta H, Shimose T, Emi Y, Imamura T, Ohnishi K, Kusumoto T, Yamamoto M, Fukuzawa K, Takahashi I, Higashi H, Tsuji A, Akagi Y, Oki E, Maehara Y, Baba H, Kyushu Study Group of Clinical Cancer ancillarys
  • Journal Title: Med Oncol Volume: 33(11) Pages: 118
  • DOI: 10.1007/s12032-016-0834-9.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chemotherapy-induced Nausea and Vomiting in Patients with Hepatobiliary and Pancreatic Cancer Treated with Chemotherapy: A Prospective Observational Study by the CINV Study Group of Japan. (2016)
  • Author(s): Nitta H, Baba H, Sugimori K, Furuse J, Ohkawa S, Yamamoto K, Minami H, Shimokawa M, Wakabayashi GO, Aiba K, Japan CSGo
  • Journal Title: Anticancer Res Volume: 36(4) Pages: 1929-35
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Prognostic value and prediction of extra-tumoral microvascular invasion among candidates for hepatectomy or liver transplantation for HCC. (2017)
  • Author(s): H. Nitta , M.-A. Allard , G. Pittau , O. Ciacio , E. Vibert , A.S. Cunha , D. Cherqui , D. Castaing , H. Bismuth , H. Baba , R. Adam
  • Organizer: EASL2017
  • Place of Presentation: Amsterdam, Netherlands
  • Year and Date: 2017-04-19 – 2017-04-19
  • Int'l Joint Research