肝内胆管癌特異的融合遺伝子を標的としたアルキル化剤の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10583
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 高木 惠子 日本大学, 医学部, 研究医員 (20339328)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 緑川 泰 日本大学, 医学部, 准教授 (10292905) ; 尾崎 俊文 千葉県がんセンター(研究所), 発がん研究グループ DNA損傷シグナル研究室, 室長 (40260252) ; 藤原 恭子 日本大学, 歯学部, 准教授 (40595708)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 肝内胆管癌 / ChB-PIP

Outline of Annual Research Achievements

融合遺伝子作製準備として、これまでにFGFR2-BICC融合遺伝子の融合領域に特的に結合するChB-PIP(クロラムブシル-PIポリアミド)の合成、確認を行った。次に、融合遺伝子発現株の作製にとりかかった。3×10 5乗cells/mlのICC(肝内胆管癌)細胞株Huh28、TKKKに対して遺伝子導入試薬リポフェクタミン3000(Thermo Fishier)を用いてトランスフェクションを行った。その後、RN easy Mini kit(Qiagen)を用いてRNAを抽出し、Real time PCRを行って遺伝子発現量を測定した。その結果、コントロール群と比較して、融合遺伝子プラスミド導入群での遺伝子発現量はHuh28株、TKKK株ともに有意に高発現であった(p<0.01)。これにより一過性発現を確認することができたため、安定株の樹立に取りかかった。安定株樹立のため、3×10 5乗cells/mlのHuh28、TKKK株にリポフェクタミン3000による遺伝子導入を行った後にG418(Geneticin)を用いてセレクションを行い、ある程度の大きさになったG418耐性コロニーを回収した。回収した細胞は、96wellプレートのスモールスケールより徐々にスケールアップをした。それら細胞よりRNAを抽出後、Real time PCRによりコントロール群と融合遺伝子プラスミド導入群との遺伝子発現量を測定した。Huh28株においては、細胞の発育に時間がかかったり、その他の問題で遅延はしたが、コントロール群と比較して、融合遺伝子プラスミド導入群での遺伝子発現量は有意に高発現であった(p<0.01)。これによりHuh28株において安定株の作製が確認できたと考えられた。今後ウエスタンブロットによっても安定株の確認を行う予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

融合遺伝子陽性の肝内胆管癌の樹立を行うため、Huh28細胞株、TKKK細胞株に対して遺伝子導入試薬リポフェクタミン3000(Thermo Fisher)を用いてトランスフェクションを行った後、、RN easy Mini kit(Qiagen)を用いてRNAを抽出し、Real time PCRを行って遺伝子発現量を測定した。その結果、コントロール群と比較して、融合遺伝子プラスミド導入群での遺伝子発現量はHuh28株、TKKK株ともに有意に高発現であった(p<0.01)。これにより一過性発現を確認することができたため、安定株の樹立に取りかかった。安定株樹立のため、Huh28、TKKK株にリポフェクタミン3000による遺伝子導入を行った後にG418(Geneticin)を用いてセレクションを行い、G418耐性コロニーを回収し細胞を徐々にスケールアップをした。それら細胞よりRNAを抽出後、Real time PCRによりコントロール群と融合遺伝子プラスミド導入群との遺伝子発現量を測定した。これらの過程で、Huh28株、TKKK株ともに発育に時間がかかり実験が遅延した。特にTKKK細胞は、FGFR2-BICC強制発現株およびコントロール細胞株のクローン化合成が困難で、繰り返し行うも合成できなかった。また、途中インキュベーターが故障し、細胞が死滅することがあった。更に、遺伝子発現量を測定するReal time PCRが故障し、使用できず実験が遅延した。

Strategy for Future Research Activity

Real time PCRの測定によってコントロール群と比較して、融合遺伝子プラスミド導入群での遺伝子発現量が有意に高発現であった(p<0.01)ことから、Huh28株における融合遺伝子発現安定株の作製が確認できたと考えられるため、今後ウエスタンブロットによっても安定株の確認を行う予定である。安定株の作製が確認された場合は、ChB-PIP投与により融合遺伝子発現安定株でのFGFR2-BICC陽性細胞特異的に抗腫瘍効果を示すかどうかを検討する。また、ChB-PIP投与により過剰発現させている融合遺伝子の発現に変化があるかどうかを検討し、ChB-PIP投与による下流遺伝子の発現への影響を確認する。その後、ChB-PIPのin vitroにおける特異的アルキル化能と抗腫瘍効果の確認を行う。

Causes of Carryover

(理由)これまでに使用してきた肝内胆管癌細胞株Huh28、TKKKの発育速度が遅く、実験が遅延した。途中インキュベーターの故障により細胞が死滅した。また、real time PCRが故障し、使用できない期間があり、現在進行状況として遅れている。そのため、融合遺伝子発現安定株の作製が遅れており、それらに使用するはずであった試薬などの消耗品を購入しなかったため。
(使用計画)FGFR2-BICC発現ベクターを導入したICC株の樹立を施行し、抗腫瘍効果をin vivo、in vitroで検討する。