2016 Fiscal Year Research-status Report
XCR1+DCへ抗原を選択的に送達する新規がんペプチドワクチン戦略の開発
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16K10608
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
勝田 将裕 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (50464673)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20191190)
松田 健司 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (30398458)
尾島 敏康 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60448785)
宮澤 基樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (90549734)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | XCL1 / XCR1 / ペプチドワクチン / ドラッグデリバリー / 樹状細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス XCL1(mXCL1)クローニングベクターを用いて、XCL1 の配列に続いてOVA257-264ペプチドと FLAG tag の配列を含むオリゴ DNA を設計し、「XCL1-OVA peptide-FLAG」plasmid DNA を 293T 細胞に transfection した後に FLAG 抗体を用いて精製することで、マウス XCL1 と卵白アルブミン（OVA）由来の抗原ペプチド（OT-I） を融合させた XCL1-OVA ペプチド連結ワクチン（mXCL1-OT-I）を作成した。この mXCL1-OT-I のマウスにおける抗腫瘍効果の検討では、OT-I ペプチド、OVA タンパクに 比較して、mXCL1-OT-I を 免疫アジュバント（TLR3 アゴニスト、poly(I:C)）と共 にマウスに投与した場合に、投与後 7 日目の抗原特 異的 IFN-γ 産生の誘導が顕著に認められた。また、OVA 発現腫瘍細胞株（メラノーマ細胞株 B16-OVA）の接種前に、 mXCL1-OT-I と poly(I:C)を 1 週間間隔で２回投与した場合に、顕著な腫瘍縮小効果も認められた。このことより、XCL1-ペプチド連結ワクチンの有効性が示唆された。さらに、腫瘍接種前のワクチン投与実験を種々の用量で比較確認し、至適投与量を確認した。また、 TLR3 の agonist である poly(I:C)を XCL1-ペプチド complex と併用することで抗腫瘍効果が増強した。腫瘍接種後の投与でも同様に抗腫瘍効果増強がみられた。さらに、XCL1ペプチド連結ワクチン投与による T 細胞への効果を検証するために、抗原特異的な T 細胞に（CTL）おいて、免疫チェックポイント分子PD-1の表現型の変化を解析したところ、ワクチン接種後に誘導されるCTLではPD-1の発現増強を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通りに実験は進捗しており、研究成果も得られているため、本研究はおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度は、mXCL1-OT-I による抗腫瘍効果の分子基盤を解明する。まず、抗腫瘍効果が XCR1+ DC に依存しているかどうか、XCR1+ DC を欠失する遺伝子改変マウスを用いて確認する。XCR1+ DC 欠失マウスとしては、XCR1 の遺伝子座に、ジフテリア毒素受容体（DTR）と蛍光タンパ ク venus の融合タンパクをコードする遺伝子をノックインしたマウス(XCR1-DTRvenus マウス)を使用する。また、XCR1+ DC に選択的にジフテリア毒素の A サブユニット （DTA）を発現させるように遺伝子改変したマウス(XCR1-DTA マウス)も使用する。この マウスでは、DTA の作用により、恒常的に XCR1+ DC が欠失している。さらに、抗腫瘍効果が XCR1 に依存しているかどうか、XCR1 欠損マウスを用いて確認する。 次に、mXCL1-OT-I が XCR1+ DC へ選択的に送達されているかどうかを、蛍光ラベルした mXCL1-OT-I 投与後に mXCL1-OT-I を取り込んだ細胞を免疫組織染色、FACS などで同定すること により明らかにする。mXCL1-OT-I は、XCR1+ DC に送達されるばかりでなく、XCR1 を介したシグナルにより、XCR1+ DC の抗腫瘍活性を増強させている可能性も考えられる。そこで、mXCL1-OT-I 投与後に XCR1+ DC を単離し、遺伝子発現プロファイルを DNA マイクロアレイで解析する。特に、免疫チェックポイント分子に焦点を当て、適宜タンパク 発現の変化についても FACS にて解析する。XCR1+ DC の単離には、XCR1+DC に選択的に蛍光タンパクを発現させたマウスを使用する。XCR1 シグナルへの依存性を確認するため、野生型マウスと XCR1 欠損マウスを比較解析する。
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Research Products
(5 results)
