2017 Fiscal Year Research-status Report

胆道癌における遺伝子変異と免疫抑制分子及びネオアンチゲン発現の解析

Research Project

Project/Area Number	16K10612
Research Institution	Tokyo Women's Medical University
Principal Investigator	有賀淳東京女子医科大学, 医学部, 教授 (40221056)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	胆道癌 / 免疫チェックポイント / 遺伝子変異 / ネオアンチゲン / 免疫療法 / エクソームシーケンス
Outline of Annual Research Achievements	胆道癌は予後が極めて不良な疾患であり、有効な治療法の開発が必須である。近年、生体内のT細胞抗腫瘍免疫応答を強く抑制する免疫チェックポイント分子が発見され、そのシグナルをブロックする抗体医薬が開発された。すでにメラノーマ、肺癌、腎癌、胃癌などで臨床効果が確認され薬事承認されており、一部の患者において著明な臨床効果を認めている。しかし、その効果発現は癌細胞のHLA分子とPD-L1分子の発現及び癌細胞の遺伝子変異と変異抗原（ネオアンチゲン）数が関連することが示唆されている。今回、胆道癌におけるHLAとPD-L1の発現及び遺伝子変異とネオアンチゲンの解析を行い、胆道癌における新規免疫治療の開発を目指して本研究を実施している。個人情報保護法の改定等により研究計画書の修正が必要となり、遺伝子変異とネオアンチゲンの解析については平成29年4月に倫理委員会の承認が得られ研究を開始した。HLAとPD-L1の発現解析は倫理委員会の審査途中であり、平成30年度の実施を予定している。胆道癌の全エクソーム解析を行うために、癌組織からのDNA抽出、DNAのクオリティチェック、ライブラリ作成、テンプレート調整、次世代シーケンサーによるエクソームシーケンスのために必要な各試薬を準備し、Ion Protonのランニング調整を行った。癌組織の採取時間を短縮するために、外科手術後のホルマリン固定パラフィン包埋標本（FFPE)の利用を検討したが、胆道癌のFFPEからDNAの抽出及びDNAのクオリティチェックでは十分な量及びクオリティのDNA採取が困難であったため、手術時の新鮮癌組織からのDNAを採取することを検討し、引き続き研究を遂行中である。手術時の新鮮癌組織を利用することにより同時にRNAシーケンスが可能となるため、新たにRNAシーケンスにてトランスクリプトーム解析を行う研究を検討している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ヒト胆道癌組織の遺伝子変異解析を実施するための遺伝子研究に関する倫理委員会での承認が得られるまでに、個人情報保護法の改定や臨床研究法の設定などにより予定以上の時間を要し、一部の研究では現在も承認審査中である。承認の得られた遺伝子変異解析について研究を進めているが、最初に試みた外科手術標本のホルマリン固定パラフィン包埋標本（FFPE)を利用した胆道癌組織からのDNA採取ではエクソームシーケンスのために必要な量とクオリティのDNAが採取困難であったため、新たに手術時の新鮮癌組織を利用する方法にて研究を進めているが、十分な癌組織量の採取が可能なケースが多くないため、研究資料の採取に若干の遅れを認めている。HLAとPD-L1発現解析については倫理委員会の審査中のため、平成30年度に実施する予定である。
Strategy for Future Research Activity	胆道癌の遺伝子変異解析研究については、すでに胆道癌からDNAを採取した後のライブラリ作成、テンプレート調整、次世代シーケンサー(Ion Proton)のランニング調整は準備が整っているため、平成30年度に引き続き胆道癌新鮮組織の採取に努めて胆道癌の遺伝子変異解析を急ぎ行っていく予定である。胆道癌のHLA発現、PD-L1発現の解析についてはすでに手術が終了した後のFFPEを利用可能であるため、倫理委員会承認後に速やかに研究を進める予定である。新鮮癌組織を利用したRNAシーケンスによるトランスクリプトーム解析については上記研究の進捗を見ながら、可能であれば並行して実施することを検討したい。
Causes of Carryover	（理由）平成29年度は平成28年度の未使用分を含めて研究計画にある次世代シーケンス用の消耗品を購入し、ヒト胆道癌組織の全エクソームシーケンス工程準備調整を行った。使用総額はほぼ予定通りの使用となったが、少額な残金については次年度に併せて使用することとした。（使用計画）平成29年度の残額と併せて、平成30年度に予定している胆道癌組織における免疫チェックポイント関連分子発現解析用の免疫組織染色キット及び各種モノクローナル抗体の購入に充てる予定である。