IL-1受容体アンタゴニスト欠損マウスを使用した血管炎の発病メカニズムの解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10666
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 伊藤 智 自治医科大学, 医学部, 講師 (30382881)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 直行 自治医科大学, 医学部, 准教授 (20382898) ; 吉崎 隆道 自治医科大学, 医学部, 研究員 (20743115) ; 山口 敦司 自治医科大学, 医学部, 教授 (50265287) ; 川人 宏次 自治医科大学, 医学部, 教授 (90281740)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 血管炎マウスモデル / IL-25 / IL-33

Outline of Annual Research Achievements

指定難病である血管炎症候群は重篤な難治性自己免疫疾患であり、病態機序の解明は未だ十分でない。血管炎へのIL-25とIL-33の関与を究明するため、自然発症血管炎モデルマウスであるIL-1Ra遺伝子欠損マウスを用いて、IL-25遺伝子欠損マウスとIL-33遺伝子欠損マウスの各々と交配し、二重欠損マウスを作成した。それぞれのマウスの大動脈基部の組織標本を作成し、H&E染色と EVG 染色を行い、血管炎の発症率を評価した。12週齢のIL-1Ra遺伝子欠損マウスでは28.5% (8/28)であるのに対して、IL-1Ra IL-25遺伝子欠損マウスでは0% (0/18, p=0.01) と減少を認めた。一方、IL-1Ra IL-33遺伝子欠損マウスでは37.5% (6/16, p=0.54)と有意差を認めなかったが、うっ血性心不全や突然死の頻度が2群に比較して高かった。心不全発症マウスの病理組織像は、弁への炎症細胞浸潤による狭窄と両心肥大を認めた。これらの結果から、IL-25欠損は血管炎の発症に抑制的に作用し、IL-33欠損は血管炎の発症には影響しないが、弁組織の炎症増悪に関わっていることが示唆された。
次に、本疾患モデルにおける、IL-25とIL-33の産生細胞を同定するため、免疫組織染色でIL-25およびIL-33発現細胞を同定した。IL-25は、大動脈血管内皮細胞とリンパ球で発現し、IL-33は炎症部位で著明に増殖した線維芽細胞核内で発現を認めた。また、GFP-IL-1Ra遺伝子欠損マウスを用いて、蛍光免疫染色でIL-1Ra発現部位が大動脈血管内皮細胞であることが分かった。
IL-25発現細胞において、血管内皮細胞と炎症細胞のどちらが関わっているかを確認するため、IL-1Ra遺伝子欠損マウスとIL-1Ra IL-25遺伝子欠損マウスの間で、骨髄移植実験を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

遺伝子欠損マウスの作成と交配・繁殖に時間を要したが、実験必要数確保することができた。
また、血管炎発症率の評価のため、大動脈病理組織作成と特殊染色・免疫染色・蛍光免疫染色結果が安定して得られた。

Strategy for Future Research Activity

骨髄移植実験後、12週齢での血管炎発症率を評価する。この結果から、血管内皮細胞でのIL-25産生が血管炎発症に関わっていた場合は、In vitroでマウス大動脈血管内皮細胞に対してIL-1βやTNF-αなどのサイトカイン添加実験を行い、産生される主要な炎症性サイトカインをELISAで測定する。一方、血球でのIL-25産生関わっていた場合は、所属リンパ節（縦隔リンパ節）を回収し、FACSでプロファイリングを行う。
IL-33は、血管炎の発症には関わっていないが、炎症細胞の分布・種類などに違いがないか、免疫細胞染色で評価を行う。

Causes of Carryover

平成28年度に骨髄移植を行い、その結果を基に血管内皮細胞または免疫細胞の培養実験を行う予定であったが、移植後の12週齢での評価をまだ行っていないため、未使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

このため、次年度に移植後の解析を行い、その結果を基とした次の実験を行い、未使用額を充てることとしたい。