2016 Fiscal Year Research-status Report
微量検体からの肺癌コンパニオン診断を可能にする基盤研究
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16K10690
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
田中 良太 杏林大学, 医学部, 講師 (40415063)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 肺腺癌 / 細胞診 / 液状化細胞診 / Liquid Based Cytology / 上皮成長因子受容体 / EGFR / KRAS / EML4-ALK融合遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では確定診断のため気管支鏡下生検の際に用いた、鉗子先端を洗浄し回収してえられた細胞材料を利用する。15mlの遠心管に10ml程度の生食を入れて、その中で出し入れして鉗子先端を洗浄する。別室の遠心分離器で細胞成分を底部に落とし、BD シュアパスTMのサイトリッチレッド保存液を用いて固定する。現在までに採取した器具洗浄液は16検体であり、同時に採取した血清材料も保存している。まずは予備実験として肺癌手術材料の腫瘍部分の割面擦過による細胞材料を用いて、目的とする遺伝子や免疫組織化学的な解析を施行してきた。LBC固定液からDNAを抽出した55検体のうち、病理組織学的に腺癌と診断された40検体のEGFR遺伝子変異を解析し、陽性率が50％（40検体中20検体）と高率であった。EGFR遺伝子変異が陰性であった20検体を対象として、KRAS遺伝子変異を解析しているところである。今後LBC固定後に細胞浮遊液ゼリー化試薬（iPGell）に埋めて作成したセルブロックを用いて、EGFR変異陰性・KRAS変異陰性例を対象としてEML4-ALK融合遺伝子の解析を免疫染色と蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization, FISH）により施行する予定である。また更に腺癌だけでなく他の組織型を含む細胞集団に対して、抗PD-L1抗体を用いた発現解析もおこなう予定である。最終的には細胞検体が微量であっても各種遺伝子解析や免疫染色が、臨床的に信頼性を担保できるものであるかを検討する。そして本研究によって最善で効率的な細胞回収と検体処理法を提示することは、肺癌コンパニオン診断をより精度が高いものへと進歩させる一助になることが期待される。それはまた今後の個別化医療の更なる発展と効率化に寄与する将来への基盤の一つになると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
気管支鏡下生検の際に採取した器具洗浄液（LBC固定液で保存）、および同時に採取した血清材料（16検体）においては未解析のまま保存中である。肺癌手術材料の腫瘍部分の割面擦過により、えられた細胞材料を用いて予備実験を開始した（73検体）。擦過材料は１検体あたり３本の遠心管に振り分け、一時的にLBC保存液で固定した。そのうちの一本は細胞浮遊液ゼリー化試薬（iPGell）を混ぜた後にセルブロックを作成し（49検体）、もう一本からは遺伝子解析のためにDNAを抽出した（55検体）。残りの一本はLBC固定のまま－80℃のフリーザーで凍結保存とした。最初にiPGellに埋めて作成したパラフィン包埋標本を用いて、各種一般的な染色法（HE染色、Papanicolaou染色など）を施行した。組織型の鑑別に関連する腺癌系マーカーとしてTTF-1とNapsin A、扁平上皮癌系マーカーとしてCK5/6とP40の免疫組織学的解析を施行した。iPGellに埋めて作成したセルブロックでも良好な染色性を示し、形態学的および免疫組織化学的な評価が可能であった。LBC固定液からDNAを抽出した55検体のうち、組織学的に腺癌と診断された40検体を対象としてEGFR遺伝子変異を解析した。高感度法の一つであるEGFR-RT52（Entrogen, Inc.）を用いてリアルタイムPCRで施行し、20検体（Exon 21; L858Rが8検体、Exon 21;L861Qが2検体、Exon 19 Delが10検体）が陽性であった。対象検体のうちEGFR遺伝子変異が陰性であった20検体を対象とし、現在KRAS-RT50（Entrogen, Inc.）を用いてKRAS遺伝子変異を解析している。今後KRAS遺伝子変異陰性例を対象としてセルブロックを用いて、EML4-ALK融合遺伝子の検索を免疫染色とFISHで施行する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずは肺癌手術材料の腫瘍部分の割面の擦過により、えられた細胞材料を用いた各種遺伝子や免疫組織化学的な解析の経験とデータをベースとして、生検によりえられた微量な細胞材料から各種解析のための最適な検体処理法を探索する。本研究の最終目標である気管支鏡下生検の際の生検鉗子の器具洗浄からえられた細胞材料を用いて、順次高感度法によるEGFR遺伝子変異とKRAS遺伝子変異の解析を施行する。えられた細胞検体では細胞数が少なくDNA濃度が極めて低いことが予想されるため、遺伝子解析のためのDNAをLBC固定液から抽出するか、セルブロックの薄切切片を用いてレーザーマイクロダイゼクションによる腫瘍細胞の分取、あるいはDNAの増幅法により感度を上げて解析するかを検討する。EML4-ALK融合遺伝子の検索のため、セルブロックを用いて免疫染色とFISHを施行する予定である。またFISHにいたる検体処理に問題がなければ、MET遺伝子増幅の有無もFISHで確認することを検討する。実験行程の中で各種遺伝子解析では腺癌を対象とした検討になるが、扁平上皮癌を含むすべての組織型を対象とした解析では、抗PD-L1抗体を用いた免疫組織学的な解析を施行する予定である。細胞浮遊液ゼリー化試薬（iPGell）に埋めて作成したセルブロック標本で抗PD-L1抗体の発現の評価が可能になれば、今後気管支鏡でえられた細胞検体をもとに免疫チェックポイント阻害剤の適応を、迅速かつ効率的に見極める一つの選択肢を提供するものと考える。またそれに相当する手術による組織材料がある場合は、同様の遺伝子および免疫組織化学的な解析を行う。その目的は細胞検体を用いた解析が、組織材料を用いた解析方法と比べて、遜色がない結果であるかを検証する。最終的には細胞検体を用いた各種解析法が、臨床的に信頼性を担保するものであるかを検討する。
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| Causes of Carryover |
当該年度の研究計画を実行して、予算内の研究費を執行してきたが、当初の予定額より若干試薬類を、安価に購入することができた。そのため若干の次年度使用額（B-A）64,991円が生じている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
この次年度使用額に関しては、本研究の中で必要とされる細胞材料を固定する、BD シュアパスのサイトリッチレッド保存液やiPGellの購入にあてる。
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