レーザープロテオミクスを用いた悪性胸膜中皮腫浸潤メカニズムの解明と臨床応用

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10703
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 宮田 義浩 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 准教授 (50397965)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 悪性胸膜中皮腫 / レーザープロテオミクス

Outline of Annual Research Achievements

近年社会問題化している悪性胸膜中皮腫（MPM）は極めて予後不良であり、その早期診断による予後改善が急務である。我々は培養細胞において癌の浸潤突起部特異的分子を同定する新技術（レーザープロテオミクス）を開発した。また病理検体からもレーザーマイクロダイセクションを用いて癌浸潤成分特異的分子を同定する技術を確立している。本研究では両技術を用いてMPMの微小浸潤に関わる分子の同定、その機能解析を進め、MPM早期診断に寄与する新規バイオマーカーの発見や治療開発を目指す。本年度は微小浸潤MPMの浸潤・非浸潤細胞からのRNA抽出を行い、網羅的比較遺伝子解析を行った。外科的に切除されたMPM検体の２つの最大割面をホルマリン固定パラフィン包埋と凍結包埋し、パラフィン切片で微小浸潤MPMと診断後、凍結包埋より薄切切片を作製し、レーザーマイクロダイセクションにて浸潤部細胞と反応性中皮細胞を速やかに分取しRNAを抽出した。微小浸潤MPMの網羅的比較遺伝子解析を行った。Cancer hot spot panel v2(CHPv2)、及びOncomine Comprehensive assayにより候補遺伝子を検討した。12例の検体からの測定により現時点でBAP1, NF2, NOTCH1, ABL1, ATM, CDKN2A, ERBB2, FBXW7, PTENが候補遺伝子としてとりあげ解析を進めて行った。同定された分子の遺伝子発現を、MPM細胞株のRT-PCR法にて確認するとともに、全長cDNAをクローニングし、遺伝子変異の有無を調べる。細胞株に由来する全長cDNAを哺乳類発現ベクターに挿入し、MPM細胞に対して遺伝子導入を行う。遺伝子強制発現によって浸潤突起形成能（細胞１個当たりの偽足突起の数、偽足突起の長さ・太さ等を調べる。同様にwound healingアッセイや穴あき透過膜（ポアサイズ8μm）遊走（transmigration）アッセイ等により、細胞運動・遊走能を調べている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

病理検体からのMPM微笑浸潤に関わる候補分子の同定には成功し、機能解析も進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

上記で同定された分子の遺伝子発現を、MPM細胞株のRT-PCR法にて確認するとともに、全長cDNAをクローニングし、遺伝子変異の有無を調べる。細胞株に由来する全長cDNAを哺乳類発現ベクターに挿入し、MPM細胞に対して遺伝子導入を行う。遺伝子強制発現によって浸潤突起形成能（細胞１個当たりの偽足突起の数、偽足突起の長さ・太さ等を調べる。同様にwound healingアッセイや穴あき透過膜（ポアサイズ8μm）遊走（transmigration）アッセイ等により、細胞運動・遊走能を調べる。更に上記遺伝子のノックダウンによりその機能を確認する。最終的には有望な分子をターゲットとした治療薬の開発につなげていきたい。

Causes of Carryover

当初、購入する予定だった実験用品を買わなくなった為、平成30年度の経費と合わせて適切に支出する。
使用計画は、学会の旅費、実験用品等の購入にあてる。