2017 Fiscal Year Research-status Report
非ウイルス的遺伝子導入法による自殺遺伝子幹細胞療法の開発とグリオーマ治療への応用
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16K10752
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
鮫島 哲朗 浜松医科大学, 医学部, 講師 (00295213)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
難波 宏樹 浜松医科大学, 医学部, 教授 (60198405)
山崎 友裕 浜松医科大学, 医学部附属病院, 診療助教 (40781050)
小泉 慎一郎 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (10456577)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 自殺遺伝子幹細胞療法 / エピソーマルベクター / HSVtk/GCV system |
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| Outline of Annual Research Achievements |
悪性グリオーマに対する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVtk)/ガンシクロビル(GCV)システムによる自殺遺伝子療法の遺伝子産物の輸送媒体として、腫瘍指向性を有する幹細胞を用いた自殺遺伝子幹細胞療法の検証を行っている。本研究ではHSVtk遺伝子を挿入したエピソーマルベクターを作成し、電気穿孔法で幹細胞に導入し、遺伝子挿入のない安全なTK幹細胞療法の開発と遺伝子産物の新規デリバリーシステムの開発を目的としている。
前年度までにpreliminaryな実験としてマウスiPS細胞由来神経幹細胞へCAGプロモーター制御下にHSVtk遺伝子を発現するプラスミドベクターを電気穿孔法により遺伝子導入し、治療細胞のマウスグリオーマ細胞(GL261-luc)に対する遊走能とバイスタンダー効果をin vitroの実験で確認した。
本年度はさらなるデータ集積のためマウスiPS細胞由来神経幹細胞で作成した治療細胞を用いてin vivo実験での検証を進めた。しかし検証の初期段階でマウスグリオーマ細胞(GL261-luc)がヌードマウスの脳内に安定して生着しないことが分かったため予備実験を終了し、予定通りin vivo実験での使用が実証されているヒトグリオーマ細胞(U87-luc)を用いたin vitro・in vivoバイスタンダー効果、遊走能の実験を進めた。また使用するヒト由来の幹細胞の培養系の確立と継代に伴う細胞形態の変化の確認を行った。
またHSVtk遺伝子導入エピソーマルベクターの作成を進めているが、preliminaryな実験に使用したHSVtk遺伝子導入プラスミドと比較してベクターサイズが大きいため導入効率の向上に向けてエレクトロポレーションの条件検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト幹細胞にHSVtk遺伝子を配列したエピソーマルベクターを導入した治療細胞の作成を目指して、現在までpreliminaryなin vitroバイスタンダー効果の検証実験、エレクトロポレーションの幹細胞に与える影響に関する検証実験を実施し良好な結果を得ている。本実験データによりエレクトロポレーションによる遺伝子導入法の幹細胞に与える影響については、有効性を減じないことが実証された。またpreliminaryなin vitro実験ではマウスiPS細胞由来神経幹細胞を用いたが、ヒト幹細胞のソースとして脂肪幹細胞、神経幹細胞、歯髄幹細胞を用いるべく培養系の確立と継代数に関係した遺伝子導入のタイミング含めた検証を行っている最中である。また遺伝子導入効率が向上しない場合の対策として薬剤耐性遺伝子を導入したエピソーマルベクターの作成を行い、in vitro、in vivoの実験に速やかに移行できるよう準備中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度中にエピソーマルベクター用いたHSVtk遺伝子導入ヒト幹細胞による自殺遺伝子療法のin vitro、in vivo実験を完遂させる。遺伝子導入効率の向上が得られない場合は薬剤選択による治療細胞のクローニングを行った上でin vitro、in vivo実験を並行して行う。
in vitro実験はヒトグリオーマ細胞(U87-luc)に対する遊走能の評価とバイスタンダー効果の検証を行う。遊走能の検証には予備実験のデータを参考にMatrigel invasion chamberを用いた実験で確認する。またバイスタンダー効果を確認するため治療細胞とU87-lucを各割合で混合してガンシクロビル投与、非投与で比較し殺腫瘍効果を確認する。
並行して治療細胞を用いたin vivo実験を進めていく。腫瘍形成抑制実験(in vivo バイスタンダー効果の評価)ではU87-luc(ルシフェラーゼ遺伝子が導入されており、バイオルミネッセンス法で腫瘍細胞数を発光強度で推定できる)に対し、治療細胞の比率を徐々に下げて混合した細胞液(1/4~1/64)をマウス脳内に共移植し、その後GCVまたはPBSを10日間腹腔内投与し、発光強度、生存期間を確認し、腫瘍形成抑制に必要な最小の治療細胞の比率を検証する。またin vivo遊走能の確認のためマウス右脳にU87-lucを移植し1週間後に対側の左脳に蛍光標識した治療細胞を移植し、その1～2週間後に脳の凍結切片を作成し蛍光免疫組織学的検査を行う。さらに腫瘍細胞のマウス脳内移植から1週間後に治療細胞を腫瘍内に移植し、ガンシクロビルを10日間腹腔内投与し生存期間を評価する腫瘍縮小実験(治療実験)や、同実験の組織切片を用いてホスファチジルセリンを指標とした正常脳組織のアポトーシスの評価を行い、安全性を確認する。
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| Causes of Carryover |
(理由)
これまで概ね研究計画に沿った実験が行われており、実験遂行者の中で大学院生の実験手技のrunning curveの上昇に伴い、ピペットやmediumの使用量が当初の計画より減少したため。
(使用計画)
当初予定していたヒト脂肪幹細胞に加えヒト神経幹細胞、ヒト歯髄幹細胞の使用することからHSVtk遺伝子導入エピソーマルベクターの追加の大量精製費用に充当する予定である。
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Research Products
(2 results)
