多様なエピジェネティクス異常に基づく悪性神経膠腫の体系化の確立と治療抵抗性の克服

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10761
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 中村 英夫 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (30359963)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 秀 拓一郎 熊本大学, 医学部附属病院, 診療講師 (40421820) ; 篠島 直樹 熊本大学, 医学部附属病院, 寄附講座教員 (50648269) ; 牧野 敬史 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (90381011) ; 黒田 順一郎 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (90536731)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 悪性神経膠腫 / エピジェネティクス / SNIP-Microarray / ヌードマウス / 薬剤耐性

Outline of Annual Research Achievements

悪性神経膠腫その治療抵抗性のメカニズムにおいて、最近ではエピジェネティクスの異常による遺伝子発現の制御が関与し、重要な役割を果たしていることがわかってきた。我々の研究の目的は悪性神経膠腫の生物学的特性を説明できるエピジェネティクスの変化を同定することである。従来から手術によって得られた臨床検体サンプルを継代培養しており、グリオーマ幹細胞を抽出する実験などをおこなってきた。それらの腫瘍細胞の染色体および遺伝子異常の検出はSNIP-Microarrayにて行い、全染色体の網羅的解析は行ってきた。いくつかの腫瘍細胞の樹立を行い、それらの生物学的特性を解析したところ抗がん剤における感受性の違いがあることが分かってきた。しかし、既存の染色体や遺伝子異常ではなかなか説明できず、やはりエピジェネティクスの状態の相違が大きくかかわっていると考えられた。現在、染色体や遺伝子異常の検出に加えて、エピジェネティクスの違いを検出することを試みている。おもにDNAのメチル化の状態を検出するわけだが、これらは培養細胞で行うと、継代を重ねていくにしたがって変化していくことが判明した。そこで我々は、一定のエピジェネティクスの状態を維持した細胞を常に安定した状態で供給できるシステムの構築を行った。具体的には手術で得られた臨床サンプルをダイレクトにヌードマウスに植え込み、大量に腫瘍細胞を増殖させ、十分な腫瘍細胞をストックし、それを最終的な実験まで使用できるようにしておくことにした。現在手術検体を得るごとにこれらの準備をおこなっている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初、臨床検体から得られた悪性神経膠腫の細胞を癌幹細胞を継代できる培養液にて培養し、増やしていたがなかなか増殖速度が遅く、時間がかかった。また、継代数を重ねていくうちに細胞の生物学的特性が変化していくことが観察された。特にサンプルとして解析を行ったエピジェネティクスの解析では継代することでDNAのメチル化の状態の変化が観察された。そこで、様々な実験を遂行していく過程において、エピジェネティクスの状態が一定の状態で悪性神経膠腫の細胞を使用できるシステム作りが最優先課題であると考えられた。最終的にはヌードマウスにダイレクトに手術検体より得られた腫瘍サンプルを植え込み、十分な量の腫瘍細胞を増殖させたのちにある程度大量にストックするシステムを構築した。腫瘍細胞のストックする量などをどれくらいにする必要があるかなどの検討にも少々時間を費やした。

Strategy for Future Research Activity

最大の関心は悪性神経膠腫におけるエピジェネティクスの変化がどのような生物学的特性を持つかである。そこで最も重視すべきは人工的にエピジェネティクスの状態を変化させないようにするということである。複数回のin vitroでの継代はエピジェネティクスの状態を徐々に変化させるという事が判明した。そこでエピジェネティクスが変わらない腫瘍細胞を実験に使用するためには、初期の段階である程度大量に手術検体から得られた悪性神経膠腫の腫瘍細胞をストックすることが必要である。現時点での対策として手術検体から得られた腫瘍細胞を培養することなくダイレクトにヌードマウスに植え込み、そこで比較的大量の腫瘍細胞を増やしてからストックするという方法をとることにした。今後バイオロジー的な実験を行うにあたって、十分な量の腫瘍細胞をストックすることを最重要課題としてしばらく取り組む。並行して行う実験として腫瘍細胞の生物学的特性を解析する方法として抗がん剤耐性の状態を見る方法を検討しているが、テモゾロミドという抗がん剤をin vitroで用い、MTTアッセイにて行う予定にしている。テモゾロマイドの濃度などに関しては検討できている。明らかにテモゾロミドに対する感受性の違いが認められる複数の悪性神経膠腫の細胞が樹立できれば、それらを用いて今後の実験を推進できると考えられる。感受性試験で差が出現したときに、その後の遺伝子解析などにも十分な腫瘍細胞が使用できるように、あらかじめDNA,RNA,たんぱく質は腫瘍細胞ごとにストックしておくことが望ましい

Causes of Carryover

悪性神経膠腫のエピジェネティクスの変化を検討するにあたって、手術検体より得られた臨床サンプルを癌幹細胞を継代する培養液にて継代培養していたが、なかなか増殖できないので、ダイレクトにヌードマウスに植え込むようにした。このため培養液に使う成長因子などの物品費が不要になった。しかし、ヌードマウスを使うために動物を購入する費用が必要と思われる。しかし、現時点でヌードマウスに植え込む実験が若干遅れており、今後動物購入費が必要になってくる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

手術検体より得られた臨床サンプルをダイレクトにヌードマウスに植え込むために、ヌードマウスが必要になり、ヌードマウスを購入する費用がかさむ可能性がある。また、同時に並行して抗がん剤耐性の培養実験も行う予定である。前年度から次年度に繰り越した費用をそれらに充てる予定である。