2016 Fiscal Year Research-status Report
神経幹細胞と腫瘍溶解ウイルスを用いた悪性脳腫瘍に対するウイルス免疫療法の研究
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16K10769
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
金井 隆一 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (50327532)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
峯 裕 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 訪問研究員 (10306730)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 腫瘍溶解ウイルス / 条件複製型HSV / 神経幹細胞 / iPS / 悪性脳腫瘍 / 膠芽腫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
悪性脳腫瘍は、脳内に広く浸潤して発育する特徴があり、化学療法・放射線治療への抵抗性も加わり、既存の治療法が奏功しない。本研究ではこの広く脳内浸潤した腫瘍細胞をも標的とするべく神経幹細胞(NSC)をキャリアとし、薬剤存在下のみ複製する変異型HSVベクターを治療分子とした系の治療効果を検討する。平成２８年度は以下の研究を行った。
In vitroでは、薬剤存在下に複製調節可能な腫瘍溶解HSVベクターを作成するべく、まずドキシサイクリン（Dox）存在下でICP4を発現する様にデザインしたシャトルプラスミド(pFLSICP4VIrtTA)を作成した。pFLSICP4VIrtTAは、in vitro実験系において、Dox存在下でICP4を実際に発現することをウエスタンブロット法で確認した。また、ICP4を欠失した複製不能型HSV(d120)が、pFLSICP4VIrtTAをトランスフェクションしたVero細胞でDox存在下にプラークを形成することを確認した。Flip-Flop HSV-BACシステムを用いて、Dox誘導性に複製開始する腫瘍溶解HSVベクターの作成に進む際の重要なステップが完了した。
In vivoでは、ヒト脳腫瘍幹細胞（MGG8）の免疫不全マウスへの脳内移植により、境界が不鮮明で非常に浸潤性の高い脳腫瘍を形成することを確認した。MGG8は腫瘍の増大に伴い、脳梁を介して対側半球へ浸潤し、経過に伴い両側大脳は肉眼的にも著名に腫脹する。Ki67染色や、抗Human nuclear antigen抗体を用いた免疫染色での観察でも、右半球では腫瘍細胞の密度が高いが、両半球ともに明らかな腫瘍と正常脳との境界は認めず、非常に浸潤性の高い脳腫瘍モデルであることが確認された。病理学的にもヒト膠芽腫と酷似した像を示すモデルであり、今後のin vivo治療実験に有用であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実施計画に基づき、薬剤存在下に複製調節可能な腫瘍溶解HSVベクターの作成に着手した。まず、ドキシサイクリン（Dox）存在下でICP4を発現する様にデザインしたシャトルプラスミド(pFLSICP4VIrtTA)を作成した。これは、元となるthe Flip-Flop HSV-BACシステムのシャトルプラスミドpFLSe-ICP4からLacZ配列を除去し、リバーステトラサイクリン 制御性トランス活性化因子(rtTA)とtetO反復配列を持つテトラサイクリン応答因子(TRE)配列とを挿入し、更にマーカーとしてmVenus配列をPGKプロモーター下流に組み込んだもので、mVenusとrtTAはIRES配列を挟んでPGKプロモーターで発現し、TREの下流でICP4が発現する様デザインしている。このpFLSICP4VIrtTAが、Dox存在下でICP4を実際に発現すること、またICP4を欠失したHSVベクター(d120)が、pFLSICP4VIrtTAをトランスフェクションしたVero細胞でDox存在下にプラークを形成すること等にて機能を確認した。続いて、Flip-Flop HSV-BACシステムを用いたウイルス作成を進めているが、Cre-recombinationのステップでトラブルシューティング中である。
同時に、in vivoでは、ヒト脳腫瘍幹細胞（MGG8）の免疫不全マウスへの脳内移植により、境界が不鮮明で非常に浸潤性の高い脳腫瘍を形成することを確認した。MGG8は腫瘍の増大に伴い、脳梁を介して対側半球へ浸潤し、経過に伴い両側大脳は肉眼的にも著名に腫脹する。Ki67染色や、抗ヒト核抗体での染色を用いた顕微鏡下の観察でも、右半球では腫瘍細胞の密度が高いが、両半球ともに明らかな腫瘍と正常脳との境界は認めず、非常に浸潤性の高い脳腫瘍モデルであることが確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
・Flip-Flop HSV-BACシステムを用い、第一段階のTetOnシステムでICP４を発現するexpression cassetteを有したシャトルベクター（pFLSICP4VIrtTA）を作成し、その機能をin vitroで確認した。現在、次段階のCre-recombinationによりこのexpression cassetteを有するHSV-BAC-shuttle cloneの作成中である。HSV-BAC（pM24-BAC）側のintegrity はアガロース電気泳動レベルでは特に問題ないことを確認しており、適宜トラブルシューティングを行う。
・iPS由来の神経幹細胞（NSC）に対する腫瘍溶解HSVベクターの障害性をin vitroで確認する。d120, hrR3, MG18Lなどの各種HSVベクターを用い、それらベクターの障害性をWST8を用いてin vitroで検討する。本研究に於いては特に、d120（ICP4を欠失し、複製できないHSVベクター）のNSCに対する障害性の評価は重要である。
・所定のHSVベクターが出来次第、in vitroで上記NSCに対する障害性の評価をDox存在下/非存在下にて行う。またDox存在下でNSCでのウイルス複製能を評価し、in vivo実験での至適MOIを決定する。また、このHSVベクターをNSCに感染させた系のヒト悪性脳腫瘍に対する殺傷能をDox存在下/非存在下で評価する。
・平成２９年度前半にこれらのin vitro実験をスムーズに行い、後半は脳腫瘍モデルを用いた治療実験を行う。
・in vivo研究では、NSCをキャリアとし、以上のTetOn-HSVベクターを用いた系の治療効果を検証することに加え、HSVベクター単独と比較して、NSCを用いた系の優位性を検証することが重要であり、組織学的検討も行う。
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| Causes of Carryover |
平成28年度は主に、Flip-Flop HSV-BACシステムを用いて、Dox誘導性に複製開始する腫瘍溶解HSVベクターの作成を行ってきたが、シャトルベクター作成、その機能の確認は、今後のin vivo 実験に備えて、最小限度の費用で行った。現在シャトルベクター(
TetOn-ICP4+)とHSV-BAC（ICP4-)との間でのrecombinationの段階でのトラブルシューティング中であるが、これは間もなく解決する問題と考えている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
引き続き、予定のウイルスベクター作成を進め、完成次第、早急にin vitroの実験を行う。in vitro実験系での結果が出揃い次第、免疫不全マウスを用いた脳腫瘍モデルでの治療実験、組織学的検討を行う予定である。平成28年度はマウスを用いた実験が限られていたため支出が抑えられたが、平成29年度は以上の研究予定であり、in vivo実験に費用を充当する予定である。
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Research Products
(1 results)
