Investigation of Immunovirotherapy for malignant brain tumors using neural stem cells and oncolytic viruses

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K10769
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 金井 隆一 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (50327532)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 峯 裕 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 訪問研究員 (10306730) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 悪性神経膠腫 / 腫瘍溶解ウイルス / グリオーマ幹細胞 / 抗腫瘍免疫

Outline of Annual Research Achievements

まず、治療効果同定のためヒトグリオーマモデルマウスを樹立した。既知のU87細胞株の他に、治療抵抗性のグリオーマ幹細胞株をヒト神経膠芽腫検体より樹立し、びまん性浸潤能を組織学的に確認した（hG008株)。同時に抗腫瘍免疫増強作用を有するoncolytic virus (OV)と抗PD1 抗体との併用を検討したため、マウスグリオーマ細胞株GL261によるモデルも樹立し、抗PD-1抗体による抗腫瘍効果も確認した。一方で、OVとして、薬剤存在下に複製調節可能な腫瘍溶解HSVベクターの作成に着手した。まず、ドキシサイクリン（Dox）存在下でICP4を発現する様にデザインしたシャトルプラスミド(pFLSICP4VIrtTA)を作成した。これは、元となるthe Flip-Flop HSV-BACシステムのシャトルプラスミドpFLSe-ICP4からLacZ配列を除去し、リバーステトラサイクリン 制御性トランス活性化因子(rtTA)とtetO反復配列を持つテトラサイクリン応答因子(TRE)配列とを挿入し、更にマーカーとしてmVenus配列をPGKプロモーター下流に組み込んだもので、mVenusとrtTAはIRES配列を挟んでPGKプロモーターで発現し、TREの下流でICP4が発現する様デザインし、このpFLSICP4VIrtTAが、Dox存在下で機能することを確認した。続いて、pFLSICP4VIrtTAとFlip-Flop HSV-BACシステムを用いたウイルス作成のため、Cre-recombinationによりこのexpression cassetteを有するHSV-BAC-shuttle cloneの作製を試み、HSV-BAC（pM24-BAC）側のintegrity はアガロース電気泳動レベルでは問題ないことを確認したが、作製は困難であり、HSV-BAC側に要因が推察された。また、In vitroで各種腫瘍溶解HSVベクター（hrR3, MG18L, d120）のヒトiPS由来NSCに対する細胞障害効果を検証した結果、特に細胞障害性が低いとされるd120でもNSCに対し、感染4日後のIC50は3.66[MOI]であり、障害性は低くはなかった。Tet-on/Tet-off System下のOV搭載に当たり、HSVを用いる場合、Dox非投与下でleakする遺伝子発現に対する対策も必要と推察された。