2017 Fiscal Year Research-status Report

iPS細胞を用いた変異型IDH1に基づくグリオーマモデルの作成

Research Project

Project/Area Number	16K10773
Research Institution	Fujita Health University
Principal Investigator	大場茂生藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (80338061)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	廣瀬雄一藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (60218849) 八幡直樹藤田保健衛生大学, 医学部, 助教 (60450607) 秦龍二藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (90258153)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	神経膠腫 / 変異型IDH / 腫瘍化 / 代謝 / iPS
Outline of Annual Research Achievements	近年の脳腫瘍に対する様々な研究成果により、WHO2016の脳腫瘍分類において分子診断が形態的診断に加えられ、神経膠腫においてはIDHの変異の有無と1p/19q codeletionの有無が診断に必須となった。Lower grade gliomaにおいては大部分で変異型IDHを有しており、変異型IDHはこれらの腫瘍のdriver mutationであると考えられている。本来IDH はイソクエン酸をアルファケトグルタル酸（α-KG）に変換するが、変異型IDH はα-KGを２－ヒドロキシグルタル酸に変換し、結果としてヒストンのメチル化やDNA のメチル化が生じ神経膠腫の発生へとつながるとされている。しかしながら、どのタイミングでIDHに変異が入るかは不明であるため、本研究ではiPS細胞を用いて未分化な状態あるいは神経幹細胞まで分化させた状態で変異型IDHを導入して腫瘍化モデルを作成しその特性を調べることを目的としている。現在iPS細胞の培養系を構築し、導入する遺伝子を組み込んだベクターを作成し遺伝子導入を開始した。また我々は、ヒト正常アストロサイト由来の不死化細胞を作成しており、この細胞に変異型IDH1 を過剰発現させることで腫瘍化させることを確認した。一方変異型Rasを導入することで腫瘍化させた、変異型IDHに依存しないアストロサイト由来の腫瘍モデルも作成した。これらの細胞を用いてがん代謝に関係している解糖系やTCAサイクルの代謝産物にいかなる変化が生じているかを評価した。また不死化細胞、変異型IDHにより腫瘍化した細胞、変異型Rasにより腫瘍化した細胞間の遺伝子発現の差異をRNAseqにて解析した。腫瘍化のおける遺伝子発現の変化や代謝の変化は、治療の標的となりうる可能性は十分あり、これらの結果をもとに新規治療法あるいは既存の治療法の効果を高める方法を探索中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ひとつにはiPS細胞に導入する予定であった変異型IDHを組み込んだベクターの作成に難渋したことが問題として挙げられる。幸いベクターは作成でき、他の細胞に導入しその発現は確認できた。もうひとつの理由としてiPSの扱いに不慣れであったため研究分担者に指導をうけつつ培養系を構築するのに時間がかかってしまった。以上のことから予定より遅れている。しかしながら、一方では既に作成してあった神経膠腫モデルを用いてRNAseqによる遺伝子発現解析、代謝の網羅的解析が終了し現在その差異を標的とした治療が有効であるかを確認中である。全体としてはやや遅れている状況である。
Strategy for Future Research Activity	ヒトiPS細胞に変異型IDH１とHPV16E6E7を導入し、セレクションを行う。ウェスタンブロットにて遺伝子の導入が予想通り行われていることを確認した後、アストロサイトへの分化を誘導する。一方、iPS細胞を神経前駆細胞へ分化させ、同様に変異型IDH１とHPV16E6E7を導入した後、アストロサイトへと分化させる。作成された細胞が永遠と増殖を続けるのか、つまり不死化したかを確認し、次にsoft agar 培地にまいてコロニーを形成するかで腫瘍化したかを評価する。アストロサイトへの分化の確認はアストロサイトのマーカーであるGFAP やGLT1の抗体を用いて細胞免疫反応で確認する。腫瘍化が確認できた場合には、変異型IDHを導入せずにiPS細胞から分化させたアストロサイトと比較することで不死化の機構の解明、腫瘍化に関連した遺伝子の探索、解糖系やTCAサイクルを中心とした代謝解析などを行う予定である。また、マウスの脳内に細胞を移植して脳内腫瘍が形成されるかも検討予定である。また、ヒト正常アストロサイト由来の人工的に作成された神経膠腫モデルを用いて行った代謝解析結果から腫瘍の不死化や腫瘍化における代謝変化に関与する経路に対しての阻害剤を使用して抗腫瘍効果を認めるか、また既存の治療法の効果を高めるかを評価する。
Causes of Carryover	873円では購入出来るものがなかったため、翌年に繰り越すことにした。