2016 Fiscal Year Research-status Report
末梢神経損傷に応答する疼痛慢性化分子の探索と治療開発
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16K10813
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
榎本 光裕 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (90451971)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
早乙女 進一 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (20401391)
大川 淳 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (30251507)
辻 邦和 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (20323694)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 慢性疼痛 / 末梢神経損傷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、神経損傷後に脊髄後角から神経終末までの一次ニューロンでのイオンチャネルの経時的発現を解析して、慢性期に特異的に関与する分子を同定することである。さらに同定した分子に対して遺伝子発現制御技術を用いて難治性疼痛治療の開発を行う。
初年度は、3つの異なる疼痛モデルマウスを作製し、カルシウムチャネルα2δサブユニット（α2δ-1）の発現を比較した。左脛骨・腓骨神経を切断し腓腹神経を温存したspared nerve injuryモデル(SNI群)、左坐骨神経を絹糸で部分結紮したpartial sciatic nerve ligationモデル（PSNL群）、ポリエチレンチューブで左坐骨神経を絞扼したsciatic nerve cuffingモデル(Cuff群)、Sham群を作製した。von Frey testで損傷6週まで経時的に計測し、知覚変化を比較した。また、経時的に腰部DRGのα2δ-1の発現パターンを各モデル間で比較した。
行動学的には、損傷3日でSNI群が最も痛覚過敏となった。Cuff群、PSNL群は損傷後、徐々に痛覚過敏を示し、Cuff群では3週目以降SNI群と同様の痛覚過敏を示した。一方、PSNL群は3週目以降痛覚過敏の悪化はなかった。α2δ-1のmRNA発現は損傷3日目ではSNIがSham群の1.6倍と最も高値を示し、徐々に発現低下を示した。PSNL群は6週目でも発現増加を示し、Cuff群では3週目でSham群の1.9倍、6週目で1.3倍と減少した。
損傷後、α2δ-1mRNA発現は各モデルで増加したが、損傷慢性期では疼痛の程度と発現パターンは一致していなかった。脳・脊髄でのα2δ-1の発現の関与や他の疼痛関連分子が疼痛慢性化に関与する可能性を示唆する結果であった。現在、TRPチャネル分子の発現やDRG以外の脊髄、皮膚についても発現解析を進めているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、当初の計画通り神経障害性疼痛モデルの作製、行動学的評価、一次求心性ニューロンでの疼痛関連分子の経時的な発現について実施可能であった。疼痛急性期、亜急性期、慢性期にわけてマウスから脊髄、DRG、疼痛領域の皮膚を採取してさらなる解析を進めているところである。カルシウムチャネルα2δサブユニット（α2δ-1）は神経障害性治療薬として発売されているプレガバリンの標的とされている。本研究結果から神経損傷に伴う腰部DRGでのα2δ-1発現は急性期での関与が高く、慢性期に対しては神経障害モデルによって反応が異なることが明らかとなった。現時点でα2δ-1は慢性疼痛に共通した疼痛関連分子でないと考えている。その他の分子について順次スクリーニングを施行していく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
腰部後根神経節でカルシウムチャネルα2δサブユニット1は神経損傷に伴って発現し急性疼痛に寄与するが、慢性疼痛にはその他の分子の関与が強いことが推測された。29年度は、当初の計画通りNaチャネルサブタイプやTRPチャネルなどの既存の疼痛関連分子についても検索を進めていく予定である。また、RNA発現以外にもウエスタンブロットや免疫染色法によってタンパク発現の解析を進めていく。計画書にある通りSNIモデルの切断パターンを変化させることでSNI特異的（最も痛覚過敏が強い）に発現する疼痛関連分子の探索を行う。疼痛分子を同定できたら運動・知覚神経の可視化が可能なThy1-YFP Tgマウスを使用して多重染色法を用いて神経線維と疼痛関連チャネルの局在を明らかにして、慢性疼痛に伴うプレシナプス、ポストシナプス蛋白の発現定量や形態変化を定量する予定である。
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| Causes of Carryover |
実験動物の購入、飼育費用が主となっている。モデル作製や行動解析は、すでに購入した物品もあり比較的安価で実行できた。多くのサンプルを採取したが、冷凍保存しているものも多く、遺伝子発現解析に伴うPCRなどの分子生物学試薬の消耗品が少なかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度も昨年と同様にマウスを使用した動物実験が中心となる。手術用マウスについては、年間で予備実験や予期せぬ死亡（全体の約10％程度）を含めると100匹程度必要となる。動物実験施設におけるマウス購入および飼育費用が必要である。遺伝子発現など分子生物学的解析には試薬が必要であり、適宜購入が必要である。組織染色には、HE染色などの一般的な染色液のほかに神経および筋細胞に特異的に反応する抗体が解析に必要であり、同部位を可視化するには蛍光標識付きの二次抗体が必要である。昨年度まとめたデータについては積極的に学会発表を行い、研究計画を遂行することでデータを追加し論文として成果をまとめる。
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