2016 Fiscal Year Research-status Report
Project/Area Number |
16K10858
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
岡本 美奈 大阪大学, 医学部附属病院, 助教 (50457008)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
名井 陽 大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (10263261)
吉川 秀樹 大阪大学, 医学系研究科, 理事・副学長 (60191558)
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Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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Keywords | M2マクロファージ / 抗炎症作用 / 骨再生 |
Outline of Annual Research Achievements |
機能の異なる炎症型(M1)および抗炎症型(M2a,M2c)マクロファージの骨再生過程におけるメカニズムについて調べるため、マウス由来マクロファージ様細胞株であるRAW264細胞から各phenotypeのマクロファージへの分化誘導を行った。M1型への分化誘導は、100ng/mL lipopolysaccharide(LPS)と20ng/mL IFNγ存在下で培養した。M2a型への分化は20ng/mL(及び20ng/mL IL13),M2c型へは20ng/mL IL10を添加し培養を行った。各phenotypeのマクロファージへの分化の確認は、RNAを回収し、qPCRで行った。M1型では、M0(control)と比較し、M1型マーカー遺伝子であるiNOSやTNFαの発現量が上昇していた。M2型では、M2型マーカー遺伝子であるmCD206やmArginaseの発現量が上昇しており、各phenotypeのマクロファージに分化していることを確認した。また、マウス骨髄を採取し、M-CSF存在下で培養を行うことによってBone marrow-derived macrophageを誘導し、同様にマクロファージの分化誘導を行った。qPCRの結果、M1型マクロファージではiNOS,TNFαの発現が、M2a型ではM2型マーカー遺伝子Arginase,Fizz1,Ym1の発現がそれぞれ上昇しており、M2cでの発現は低かった。誘導されたM2aとM2cは異なる機能を有すると考えられていることから、M2マクロファージについてより詳細な機能の解明が期待できる。また、RAW264およびマウス骨髄からそれぞれ分化させたM2型マクロファージでは、M2型マーカーの発現に相違が認められた。本研究ではこれまでの報告を参考に、骨髄由来のマクロファージを用いた検討を行うこととする。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
H28年度は、マウス由来マクロファージ様細胞株やマウス骨髄由来マクロファージを用いていずれの細胞からも炎症型(M1)および抗炎症型(M2)への分化誘導が行われることを確認した。一方で、細胞株と骨髄から得られたM2型マクロファージの一部のマーカーにおいて発現に相違が認められたため、今後の実験に使用するM2型マクロファージについての検証に時間を要した。このため、今後予定している実験の進め方に多少の遅れが生じたものの、分化手法を確認し、培養時のCM (conditioned media)も回収しており、今後の検討実験は進めやすいと考える。
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Strategy for Future Research Activity |
拮抗する作用も含め、それぞれ異なる機能をもつとされるM1型、M2(M2a,M2c)型への分化誘導をin vitroで確認できたことから、其々のマクロファージの有する骨再生への作用について検討を行う。マウス骨髄から各phenotypeマクロファージへ分化誘導を行い、骨関連細胞である骨芽細胞や破骨細胞を用いて、骨分化へ与える影響について検討する。M1/M2マクロファージ細胞自身、あるいは各phenotypeのマクロファージが産生するサイトカインがMSCの多分化能や骨関連連細胞の骨分化へ与える影響について、培養時のCM(conditioned media)を用いて検討を行う。また、骨分化を促進することが明らかになれば、その最適な条件(液性因子、膜結合型、各phenotype)においてscaffoldを担体にしてマクロファージおよびMSCをマウスの背部皮下に移植し、骨形成誘導能についてin vitro,in vivoでの解析を行う予定である。さらに、マクロファージの各phenotype(M2a,M2c)の違いが骨分化に与える影響について調べるため、骨折モデルを作成する。骨折炎症部位でのマクロファージの動態解析や骨折炎症部位へマクロファージを局所投与し、骨修復促進効果の有無について生化学的手法や免疫染色などによる組織評価などにより、検討を行う予定である。
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Causes of Carryover |
H28年度は主に動物を用いた検討を行う前にセルラインを用いた検討を行ったため、動物購入費は想定された使用予定額よりも少なかった。マクロファージのM1,M2型への分化誘導を行うため、マウス由来マクロファージ様細胞株RAW264細胞を用いて検討を行った。各phenotypeのマクロファージへの分化の確認は、主にqPCRを用いた解析を行った。分化を確認後、マウス骨髄由来マクロファージを用いた分化誘導実験を行ったが、セルラインを用いた際と同様の手法であったため、特にprimer等は同じ試薬を利用できたことから、初年度使用額に相違が生じた。
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Expenditure Plan for Carryover Budget |
H29年度は主に、マウス骨髄から分化誘導させたM2マクロファージを用いて実験を行う予定であり、動物の購入費が必要となる。分化させた各phenotypeのマクロファージや培養時に回収したconditioned mediaを用いてFACSやELIZAなどの解析を行い、間葉系幹細胞を用いたin vitroの検討を行う予定である。また、scaffold(担体)を用いた動物への移植実験を行う予定であり、RNAやタンパクなどの分子生物学的評価に要する試薬の購入、免疫染色法を用いた組織評価に要する試薬の購入が必要となる。
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