2018 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of the regulatory mechanisms of alternative splicing that regulate cartilage development, hematopoietic differentiation and tumor suppression
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16K10887
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
池田 敏之 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (80322759)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 選択的スプライシング / 血液型D抗原 / SRSF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RhDのエクソン7に結合するSRSF分子を同定するためにFlag-tag付きのSRSF強制発現系を用いてRNA pulldownを実施。抗Flag抗体を用いたウェスタンブロッティングにてスクリーニングを行った。RNA pulldown の実験条件なども適宜変更しながら実験を重ねた結果、SRSF3, SRSF8, SRSF9などとの結合が観察された。このうち960G>A変異により配列特異的に結合の減弱を認めたのは結局SRSF3であった。RNA-EMSAでも条件を変更して検証したところ抗体スーパーシフトでSRSF3とRhDエクソン7配列の特異的結合が確認された。EMX2のエクソン2、p63のエクソン13についても選択的スプライシングにかかわるSRSF分子やその他のスプラソソーム構成分子を同定するためのRNA pulldown の系を新たに作成した。WeakD/Delの原因変異を導入したカセットベクターについては日本人で報告のある変異について順次作成を行ったがスプライシング異常をきたす変異の同定にはいたっていない。また変異部位がきわめて多く、すべての変異のスクリーニングを終了させることはできなかった。p63の選択的スプライシングでHalo-tag蛋白の発現が消失するモニタリング細胞を用い、軟骨分化作用をもつβisoform へのスプライシングを誘導する化合物をミニライブラリを用いてスクリーニングした。いくつか有望な候補が得られたが、未分化軟骨細胞株C3H10T1/2へこれら候補化合物を作用させALP活性の出現の有無で軟骨分化誘導能を評価したところ、少なくとも単独で軟骨分化を誘導可能な化合物を見出すことはできなかった。
SRSF1、SRSF11、TRA2Bのヒト間葉系幹細胞へのアデノウィルス強制発現系で実際にCOL2A1, SOX6などがmRNAレベルで誘導されていることを確認した。
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