ヒストン修飾変化により発現制御される遺伝子Vopp1の破骨細胞における作用の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10889
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 中村 春彦 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (60755677)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 廣瀬 旬 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (00456112) ; 門野 夕峰 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70401065)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 骨代謝 / 破骨細胞

Outline of Annual Research Achievements

予備実験においては、破骨前駆細胞およびRANKL刺激により分化した破骨細胞に対してChIPシークエンス法を用いてヒストン修飾パターンの全ゲノム的解析を行い、ヒストン修飾が活性化する遺伝子群を同定し、さらにRNAシークエンスでRANKL刺激後に発現量が増加しているものとしてVopp1を候補遺伝子として選択した。
平成28年度には、そのデータを用いてVopp1のヒストン修飾変化について解析し、RANKL刺激による破骨細胞分化に伴いヒストン修飾がH3K4およびH3K27の両方がトリメチル化された状態からH3K27のみが脱メチル化された活性型に変化することを確認した。また、マウスの長管骨骨髄から細胞を採取しRANKLおよびM-CSFの存在下で培養し破骨細胞様のTRAP陽性多核細胞へと変化させる系において経時的にRNAを採取し、それを用いたRealtime PCRを行い、破骨細胞の分化に伴いVopp1の発現が増加していることを観察した。
平成29年度には、Vopp1のshRNA(short hairpin RNA)を用いて上記の破骨細胞分化系においてVopp1のノックダウンを行い、破骨細胞分化、機能について解析したが、対照群と比較して明らかな有意差は観察されなかった。
今後は、上記のノックダウンの系において破骨細胞の生存能の解析を実施し、また、Vopp1のfloxマウスを購入し、破骨細胞特異的なVopp1ノックアウトマウスを作成し、in vivoでの骨形態の解析および長管骨骨髄細胞を用いたex vivoでの破骨細胞分化、機能、生存能の解析を実施する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成28年4月から所属施設が変更となり、実験を開始するまでの準備期間を要したことによる遅れが継続している

Strategy for Future Research Activity

RANKLによる破骨細胞分化系においてshRNAを用いてVopp1の発現を抑制し、破骨細胞の形態や数、破骨細胞関連分子の発現量を経時的に解析し、破骨細胞の生存能に起こる変化を解析する。また、Vopp1のfloxマウスを購入し、Ctsk-Creマウスと掛け合わせ、Vopp1の破骨細胞特異的遺伝子欠損マウスを作成し、骨形態や破骨細胞分化への影響を解析する。

Causes of Carryover

(理由)
平成28年4月に研究代表者の所属施設が変更となったため、実験開始の準備に時間を要し、新施設での実験が遅延しているため
(使用計画）
実験をペースを早めて実施する予定である。