筋骨格系の異所性骨化症の発症分子機構の解明と治療法開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10892
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 江面 陽一 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (50333456)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 異所性骨化 / 靭帯骨化 / 腱内骨化 / 外傷

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、外傷誘発性の異所性骨化に随伴する石灰化阻害因子や石灰化促進因子の発現制御と炎症応答の関与を解明するため「マウスの踵骨腱切離モデル」を用いて検討している。【1】異所性骨化の分子メカニズム解明へのアプローチとして、まず「踵骨腱切離モデル」における加齢の影響を検討した。5-10-15-20週齢マウス（C57BL6/J系統）を用いて、術後8週間の時点で腱内骨化レベルを比較検討し、石灰化病巣の組織形態像と石灰化制御因子の発現レベルとの関連を検討した。各週齢マウスに形成された石灰化巣は比較的軽微であり、観察期間および手術侵襲の程度に修正負荷を加えることで、より明確な評価を得る予定である。手術手技の追加および変更に加えて、遺伝子改変マウスを利用したモデル実験系を追加することで、損傷腱に生じる骨化機転をより明確化して検討する計画であり、本年度はその導入計画を進めた。【2】つぎに「炎症に伴う異所性骨化の制御因子の発現制御」については、研究室で樹立された腱細胞株ＴＴ－Ｄ６細胞を用いて、炎症性サイトカインおよび活性酸素の影響について検討を進めた。腱細胞の炎症性応答に基づく細胞死と骨芽細胞系譜への分化シフトの起こりうる現象を見い出したが、この現象が生体応答としての靭帯および腱内骨化病巣形成に寄与する可能性について検討するため、上記モデルにおける組織内サイトカイン、成長因子、神経分泌因子、脂質メディエーター等の組織レベルの検討を進める。モデル実験系における組織抽出液に加えて、血清および尿中レベルを加えた計測計画を含め、その解析手法に関する準備検討を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

まず「マウスの踵骨腱切離モデル」における週齢ごとの異所性骨化病巣の形成過程の相違について、当初の計画どおり、モデル実験系の検討を進めた。石灰化病巣形成の特性を形態および組織内の遺伝子発現レベルの角度から評価検討するという点において計画どおりである。当初想定されたように、この実験系における各週齢のマウスにおける骨化病巣形成は比較的軽微にとどまるため、週齢ごとの病巣特性の比較は必ずしも明瞭ではない。したがって、この実験系に各種の手術侵襲を追加負荷し、外的因子の異所性腱内骨化に及ぼす影響を、正確に行う必要があるが、想定内の計画であり、そのような検討によって、今後、外傷機転別の評価判定から異所性骨化および腱内石灰化病巣形成に関するメカニズムを推定してゆく。なお手術手技の追加修正に加えて、骨化進展が著しく進行する遺伝子改変マウス（Slc29ａ1遺伝子欠損マウス）を導入して解析精度を向上させる計画についても準備を進めた。業者保管状況の確認が遅れたため、年度内の納品計画は5月に繰り越されたが、計画は概ね順調に進行している。
「炎症に伴う異所性骨化の制御因子」の検討についても計画通り、「細胞培養系における外的刺激が石灰化進行に及ぼす影響」について検討を進めた。従来から行ってきた間葉系前駆細胞に加えて、研究室で樹立した腱細胞株ＴＴ－Ｄ６細胞における細胞応答として、過酸化水素に対する細胞死と骨芽細胞様の発現プロファイルの変化が起きることを見いだした。そのような現象がインビボモデル実験系における腱内骨化病巣形成に寄与する可能性について、組織抽出液中の各種液性因子レベルを検討することで解明することが当初の計画であったが、今年度は測定実施の方法論を検討した。測定項目によっては血清および尿中レベルを比較解析することで、検討を進める予定であり、計画は概ね順調である。

Strategy for Future Research Activity

「マウスの踵骨腱切離モデル」における週齢ごとの異所性骨化病巣の形成過程の相違については、手術手技を追加することで、炎症性刺激、加齢、神経損傷のいずれの因子がどのような病巣形成に寄与するかをさらに解明してゆく。初年度の検討において本モデル系実験の形成する巣形成は比較的軽微であったが、手術手技を追加することによってこの点を改善するとともに、病巣形成に関わるリスク要因の同定を進める。遺伝子改変マウス（Slc29ａ1遺伝子欠損マウス）の導入は今年度早期（5月）に予定されており、繁殖ののち追加手技を含めたモデル実験系の解析を予定している。本検討による解析精度の向上が望まれ、また細胞外ピロリン酸およびアデノシンの影響を検討できる計画である。「炎症に伴う異所性骨化の制御因子」の検討については、細胞培養系における外的刺激が石灰化進行に及ぼす影響についてさらに検討を進める。腱細胞株ＴＴ－Ｄ６細胞における細胞応答として、過酸化水素負荷が細胞死と骨芽細胞様の発現プロファイルを誘導する現象をすでに見いだしているが、炎症性刺激や神経損傷などの負荷との相互作用が腱組織の過形成と骨化を誘導する仕組みは未解明であり、そのような複合的要因がインビボモデル実験系における腱内骨化病巣形成に寄与する可能性について、組織抽出液中の各種液性因子レベルを検討することで明らかにしてゆく。組織抽出液における測定に加えて血清および尿中レベルの検討によりアデノシン、ピロリン酸と炎症性サイトカイン、酸化ストレスおよび神経分泌因子が誘導する異所性骨化の分子機構解明を目指す。

Causes of Carryover

本研究計画は当初の研究計画に従って順調に進められているが、直接経費の使用額は当初の計画を下回り、456,540円が次年度使用額となった。この理由は、導入を当初から計画していた遺伝子改変マウス「SLc29A1遺伝子欠損マウス」の納品が遅れたためである。本系統マウスの購入にあたり、業者内におけるアベイラビリティの問題から、当初計画した期間を超えて輸入される見込みとなったためである。このマウスは本年（2017年）5月中に納品される予定であることから、研究計画はほぼ当初の予定どおり遂行される。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上記のとおり、遺伝子改変マウスの購入費として、予定どおりの予算執行が行われる。