2016 Fiscal Year Research-status Report
microRNAとエクソソーム解析によるメカニカルストレスの関節軟骨への作用解明
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16K10905
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
大月 孝志 岡山大学, 保健学研究科, 非常勤研究員 (10534802)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古松 毅之 岡山大学, 大学病院, 講師 (20432651)
西田 圭一郎 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (80284058)
廣畑 聡 岡山大学, 保健学研究科, 教授 (90332791)
品岡 玲 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (90724500)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | マトリックス / miRNA / エクソソーム / アグリカン / 変形性関節症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今までの我々の研究によりメカニカルストレスにより軟骨細胞においてマトリックス分解酵素の発現抑制が誘導出来ること、また適度なメカニカルストレスを与えることでマトリックス成分の発現誘導を行えることを見出している。これらのことを踏まえ軟骨様細胞株OUMS-27に対し種々のメカニカルストレスを負荷、細胞からmicroRNAを回収し、microRNAアレイ解析を行った。メカニカルストレス負荷によりその発現が上昇しtargetScan、PITA、DIANAなど複数のアルゴリズムを用いてそのターゲットがADADMTS、MMPなどのマトリックス成分分解関連因子である可能性の高いmiRNAを複数選択した。
これら候補miRNAに対し、それぞれの配列特異的阻害剤を細胞に添加しmiRNAターゲット遺伝子の経時的発現変化をタンパクレベルで解析した。複数のmiRNAにおいて標的タンパクの発現上昇を確認した。またメカニカルストレスを添加することにより標的タンパクの発現上昇がみられた。
軟骨細胞OUMS-27に対しメカニカルストレスを負荷し培養上清中に産生されるエクソソームを超遠心法、カラム法で回収し比較した。超遠心法は収量が少なく、逆に行程数、時間も多い為カラム法で今後は回収することとした。メカニカルストレスの個体レベルの解析としてラットOAモデルのトレッドミルによる走行負荷試験を行った、現時点では十分な個体数になっておらず統計的有意な差ではないが適度な走行負荷条件では軟骨の損傷抑制傾向がみられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
軟骨様細胞株OUMS-27でメカニカルストレスにより変動するmiRNAでありそのターゲットがマトリックス成分関連因子であるmiRNAを見いだした。更にmiRNAの配列特異的阻害剤を細胞に添加しmiRNAターゲット遺伝子の発現変化をタンパクレベルで抑制した。ある条件下で変動するmiRNAを見出すのは比較的容易であるがそのmiRNAが制御する遺伝子を見出すことは非常に困難であることが多い。今年度標的タンパクまで解析できたことは大きな進展であると考えている。また、マトリックス成分制御miRNA候補も検出できている。
軟骨細胞OUMS-27に対しメカニカルストレスを負荷し培養上清中に産生されるエクソソームの調製方法の検討を終えた。メカニカルストレスの個体レベルでの解析を行い、試験数は少ないながらも今後の方針決定を行うに足る結果を得ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回見いだしたmiRNAの発現ベクターを軟骨細胞に導入、過剰発現を行い標的遺伝子産物の変化をmRNA、タンパクレベルで確認する。またアグリカン、ADAMTS、MMP特異的アグリカン分解断端を検出することにより軟骨破壊作用との関連性についても解析していく予定。ラットOAモデルにおいて経時的に滑液、さらにエクソソームを回収、miRNAを精製しin vitroにおいて見出したmiRNAの変動を調べる。個体レベルの検討においては試験数を増やし検討していく予定である。
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| Causes of Carryover |
消耗品購入に充てる予定であったが統括者の購入品をシェアしたため本年度は必要なかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度消耗品等に充当する。
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[Presentation] Expression and proteolysis of the proteoglycan versican in the tumor microenvironment2016
Author(s)
Keiichi Asano, Tyler Alban, Courtney Nelson, Junko Inagaki, Takashi Ohtsuki, Shozo Kusachi, Yoshifumi Ninomiya, Toshitaka Oohashi, Suneel Apte, Satoshi Hirohata
Organizer
American Society for Matrix Biology Biennial Meeting 2016
Place of Presentation
Florida, USA
Year and Date
2016-11-13 – 2016-11-16
Int'l Joint Research
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