Analysis of cartilage protection by mechanical stress -miRNA and extracellular vesicles functions in osteoarthritis-

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K10905
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 大月 孝志 岡山大学, 保健学研究科, 非常勤研究員 (10534802)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古松 毅之 岡山大学, 大学病院, 講師 (20432651) ; 西田 圭一郎 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (80284058) ; 廣畑 聡 岡山大学, 保健学研究科, 教授 (90332791) ; 品岡 玲 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (90724500)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: マトリックス / micro RNA / エクソソーム / アグリカン / 変形性関節症

Outline of Annual Research Achievements

関節液を遠心（低速、高速）、酵素処理し滑液からのエクソソーム（EVs）を精製法を確立した。精製した粒子については粒子径分布分析をおこない直径が30-200nmであること、電子顕微鏡観察を行い脂質２重膜構造を持つ球状構造であること、マーカータンパクをウェスタンブロット分析を行いCD9を含有すること、RNA含量測定を行いRNAを含有することを確認した。軟骨細胞培養上清からもEVs回収を行った。既報の情報と比較・検討し精製された粒子がEVsであることを確認した。
軟骨細胞の培養上清から回収したEVsを用いてまたEVsの軟骨細胞への添加試験を行い、必要な培養上清量、添加時間を検討しEVs添加試験系を確立した。サイトカイン処理した培養軟骨細胞の培養上清から回収したEVsを軟骨細胞に添加し、マトリックス成分（アグリカン、２型コラーゲン）、マトリックス分解酵素（ADAMTS4、5、9、MMP-13）、ヒアルロン酸分解酵素（KIAA1199）mRNAの発現変化をRT-PCR法を用いて解析した。
ラット変形性関節症モデルを用いたEVs解析の結果から滑液量、滑液中のEVs量が共に非常に少なく、現時点の検出感度では解析に供することが困難と判断した。そこでラットOAモデルの血液を用いて解析を行うことにした。血液由来EVsからはRNAを回収し、EVs含有RNAの概算が出来るようになった。
軟骨細胞に対しメカニカルストレスを与え、炎症性サイトカインで誘導されるマトリックス分解酵素発現を抑制する可能性のあるmicro RNAを複数同定した。これらmicro RNAのアナログ、阻害剤で軟骨細胞を処理し、タンパクレベルでのプロテオグリカン分解酵素産生抑制、ヒアルロン酸分解因子産生抑制を確認している。マトリックスのメジャーな成分であるプロテオグリカン、ヒアルロン酸の代謝に関与するmicro RNAを同定した。

Research Products

• [Journal Article] A High-Fat and High-Cholesterol Diet Induces Cardiac Fibrosis, Vascular Endothelial, and Left Ventricular Diastolic Dysfunction in SHRSP5/Dmcr Rats. (2018)
  • Author(s): Watanabe S, Kumazaki S, Kusunoki K, Inoue T, Maeda Y, Usui S, Shinohata R, Ohtsuki T, Hirohata S, Kusachi S, Kitamori K, Mori M, Yamori Y, Oka H.
  • Journal Title: J Atheroscler Thromb Volume: 25 Pages: 439-453
  • DOI: 10.5551/jat.40956.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Host-produced ADAMTS4 inhibited early stage of tumor growth. (2018)
  • Author(s): Asano K, Edamatsu M, Hatipoglu O F, Cilek M Z, Inagaki J, Ohtsuki T, Oohashi T, Hirohata S.
  • Journal Title: Acta Med Okayama. Volume: 2018 Pages: 257-266
  • DOI: 18926/AMO/56071
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] High molecular weight hyaluronan protects cartilage from degradation by inhibiting aggrecanase expression. (2018)
  • Author(s): Ohtsuki T, Asano K, Inagaki J, Shinaoka A, Kumagishi-Shinaoka K, Cilek MZ, Hatipoglu OF, Oohashi T, Nishida K, Komatsubara I, Hirohata S.
  • Journal Title: J Orthop Res. Volume: 36 Pages: 3247-3255
  • DOI: 0.1002/jor.24126
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Isolation and characterization of extracellular microvesicles in osteoarthritis (2019)
  • Author(s): Liu Guole, Takashi Ohtsuki, Akira Shinaoka, Kana Komatsu, Yurika Notsu, Omer Faruk Hatipoglu, Takuto Nishimur, Miho Tatii, Junko Inagaki, Hiroshi Yamada, Keiichiro Nishida, Sun Liankun, Satoshi Hirohata
  • Organizer: The 32th Annual meeting of the Japanese Society of Cartilage metabolism
• [Presentation] Isolation and characterization of Osteoarthritis concerning microRNA (2018)
  • Author(s): Takashi Ohtsuki, Omer Faruk Hatipoglu, Akira Shinaoka, Mehmet Zeynel Cilek, Takuto Nishimura, Keiichi Asano, Junko Inagaki, Toshitaka Oohashi, Keiichiro Nishida, Yasunori Okada, Satoshi Hirohata
  • Organizer: Joint Conference of 50th Annual Meeting of the Japanese Society of Connective Tissue Research (JSCTR)
• [Presentation] Silencing of Important Molecules in Pathogenesis of Idiopathic Pulmonary Fibrosis via RNA interference (2018)
  • Author(s): OF Hatipoglu, E Uctepe, E. Gunduz, M. Gunduz, M. Aca, T Ohtsuki, J Inagaki, S Hirohata
  • Organizer: Joint Conference of 50th Annual Meeting of the Japanese Society of Connective Tissue Research (JSCTR)
• [Presentation] Eosinophyl derived cationic protein purification and cardiomyoblast protection activity (2018)
  • Author(s): Takuto Nishimura, Miho Tachiki, Junko Inagaki, Omer faruk Hatipogl, Takashi Ohtsuki, Kentaro Ikemura, Liu Guole, Satoshi Hirohata
  • Organizer: The 13th JAPANESE ASSOCIATION OF MEDICAL TECHONOLOGY EDUCATION
• [Presentation] Isolation and characterization of matrix degradative microRNA (2018)
  • Author(s): Takashi Ohtsuki, Omer Faruk Hatipoglu, Akira Shinaoka, Mehmet Zeynel Cilek, Takuto Nishimura, Keiichi Asano, Junko Inagaki, Toshitaka Oohashi, Keiichiro Nishida, Yasunori Okada, Satoshi Hirohata
  • Organizer: 10th Annual Meeting of the Japan CCN family study group
• [Presentation] Analysis of cartilage matrix degradation and regeneration mechanism (2018)
  • Author(s): Takashi Ohtsuki, Liu Guole, Omer Faruk Hatipoglu, Akira Shinaoka, Junko Inagaki, Ken Takahashi, Hiroshi Yamada, Toshitaka Ohashi, Keiichiro Nishida, Yasunori Okada, Suneel S, Apte, Satoshi Hirohata
  • Organizer: Brainstorming 2018
• [Presentation] Purification and characterization of exosome from chondrocyte conditioned medium and analysis of exosome up-taking mechanism in chondrocyte (2018)
  • Author(s): Liu Guole, Takashi Ohtsuki, Akira Shinaoka, Kana Komatsu, Yurika Notsu, Omer Faruk Hatipoglu, Takuto Nishimura1, Miho Tatiki, Junko Inagaki, Hiroshi Yamada, Keiichiro Nishida, Sun Liankun, Satoshi Hirohata
  • Organizer: Brainstorming 2018
• [Presentation] Mechanical stress attenuated inflammatory cytokines induced matrix degradative enzymes expression in chondrocyte by inhibition of NF-kB translocation (2018)
  • Author(s): Takashi Ohtsuki, Omer Faruk Hatipoglu, Guole Liu, Akira Shinaoka, Keiichi Asano, Takuto Nishimura, Junko Inagaki, Keiichiro Nishida, Toshitaka Oohashi, Satoshi Hirohata
  • Organizer: American Society for Matrix Biology Biennial Meeting 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Isolation and characterization of extracellular microvesicles in osteoarthritis (2018)
  • Author(s): Liu Guole, Takashi Ohtsuki, Akira Shinaoka, Kana Komatsu, Yurika Notsu, Omer Faruk Hatipoglu, Takuto Nishimur, Miho Tatii, Junko Inagaki, Hiroshi Yamada, Keiichiro Nishida, Sun Liankun, Satoshi Hirohata
  • Organizer: The 41st Annual Meeting of the molecular Biology Society of Japan