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2017 Fiscal Year Research-status Report

内軟骨性骨化における後縦靭帯骨化症関連遺伝子STK38Lの役割と標的分子の解析

Research Project

Project/Area Number 16K10910
Research InstitutionKagoshima University

Principal Investigator

栫 博則  鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (50423728)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 前田 真吾  鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (60353463)
河村 一郎  鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, その他 (90535832)
小宮 節郎  鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (30178371) [Withdrawn]
冨永 博之  鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (20750798)
Project Period (FY) 2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords後縦靭帯骨化症 / STK38L / 骨芽細胞 / 軟骨細胞 / セリン・スレオニン・キナーゼ
Outline of Annual Research Achievements

マウス各種細胞株を用いてStk38lのsiRNAノックダウンを行なった結果、骨芽細胞分化成熟は亢進した。しかしST-2やC3H/10T1/2などの未分化細胞で検討すると、骨芽細胞へのcommitは抑制され、軟骨細胞分化は促進した。すなわちSTK38Lは骨軟骨分化ポテンシャルを有する未分化細胞の分化を骨芽細胞方向にシフトする機能が予測された。後縦靭帯骨化症(OPLL)の病因として、後縦靭帯が肥厚・変性し軟骨細胞様に分化し、内軟骨性骨化に似た形態を取ることも指摘されていることから、STK38LがOPLL発症初期(軟骨様変性期)には抑制的で、OPLL形成期(骨芽細胞分化期)には促進的にはたらく事が予測された。STK38Lはセリン・スレオニン・キナーゼ(リン酸化酵素)であるが、骨と軟骨の分化に促進的な骨形成蛋白(BMP)シグナルも受容体および下流伝達因子SMADのセリン残基のリン酸化を介してシグナル伝達が進む事から、STK38Lの分化調節効果は、BMPシグナルを介する可能性を考えた。軟骨細胞ATDC5においてBMP-6刺激によるSmad1/5/8のリン酸化へのsiStk38lの影響をウエスタン・ブロットで解析すると、十分なノックダウンが得られたにも関わらず、Smadのリン酸化レベルは変わらなかった。
そこで、STK38LのSMAD以外のリン酸化基質を検索する為に、セリン・スレオニン・キナーゼ基質ペプチド・アレイ(CelluSpots)解析をCOS-7細胞におけるtransient transfectionでの強制発現系で行なった。その結果、tau蛋白のリン酸化レベルの低下を検出した。tauはアルツハイマー病と関連の深い蛋白であるが、骨軟骨細胞分化との関わりは全くなく、さらなる解析が新たな知見を導く可能性が浮上した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

STK38L発現アデノ・ウイルスは完成している。
In vitroにおけるノックダウンによる骨軟骨細胞分化へのSTK38Lの影響の評価はほぼ終了している。
STK38Lのリン酸化基質として新たにtau蛋白の可能性を見出した。
そもそもSTK38LがOPLL発症に関与するのか、それはOPLL臨床組織における発現の有無にかかっており、これについて最終的な評価をする。具体的には、STK38Lの免疫組織化学染色であるが、その条件設定は終了している。

Strategy for Future Research Activity

OPLL臨床組織におけるSTK38Lの免疫組織化学染色を、サンプル数を増やして綿密に検討する。
STK38Lアデノ・ウイルスを用いて強制発現系における骨軟骨細胞分化への影響を検討する。
STK38LとファミリーであるSTK38との機能的相補性の可能性があり、STK38L単独ノックダウンでは表現系が明確に出ていない可能性があるので、STK38とのダブル・ノックダウン実験を行う。
骨軟骨細胞株の分化過程におけるtau蛋白のリン酸化レベルをウエスタン・ブロットで検討する。また、STK38Lのノックダウンによる影響を併せて解析する。

Causes of Carryover

STK38Lの機能解析において、in vitroでの解析、特に標的基質の同定が進み、この解析を優先するために、遺伝子改変マウス作製の優先順位が低下した。
セリン・スレオニン・キナーゼ・基質アレイ解析が予想よりも順調に進んだので、反復実験が不要になった。
次年度使用額については、標的遺伝子解析の反復実験による再現性確認とともに、遺伝子改変マウス作製を筆頭に、使用計画に準じた執行を行う予定である。

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Published: 2018-12-17  

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