骨芽細胞による石灰化を制御する新規血清タンパク質の同定

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K10915
• Research Institution: Niimi College
• Principal Investigator: 佐々木 順造 新見公立大学, 看護学部, 教授(移行) (30093686)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤田 洋史 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (20423288) ; 岡 剛史 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (50160651) ; 瀧川 朋亨 岡山大学, 大学病院, 助教 (80613166)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 石灰化 / 死細胞 / 血清 / 質量分析

Outline of Annual Research Achievements

間葉系幹細胞の骨芽細胞分化に伴い石灰化が誘導される。この分化誘導には高密度培養が要求され、細胞死が誘導されることが明らかである。私たちは、この死細胞の石灰化機構を明らかにする中で、血清タンパク質の中に石灰化因子含まれることを見出した。血清中に含まれる新規石灰化因子探索のため、ヒト間葉系幹細胞を凍結融解して死細胞を作製後、血清存在下非存在下で反応を行った。これらをSDS-PAGEにより分離した結果、血清存在下で死細胞に結合したタンパク質と推測されるバンドが複数検出された。このバンドを切りだし、in gel digestion後、質量分析により同定し、石灰化関連因子の候補分子とした。また、SDS-PAGEは巨大分子や10kDa以下の分子の分離には適さない。これらの分子の中からも候補分子を得るには、SDS-PAGEによる分離ではなく、トリプシン消化後分離すれば解決することを見出した。そこで、石灰化反応後の死細胞を回収し、そのままアクリルアミドゲルに封入した。その後分離をせずにin gel digestionし、LC-MSシステムにより分離・同定をおこなった。以上より複数の石灰化候補分子を同定した。さらに、候補分子が石灰化に関わるかどうかをin vivoで調べるため、CRISPR/Cas systemの実験系を構築した。マウス受精卵を体外受精により取得し、Cas9およびgRNA存在下エレクトロポレーションすることにより、ノックアウトマウスが作製できることが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

死細胞に関連した石灰化候補分子の同定を質量分析で行うところまで遂行できた。また、同定分子の機能の同定に有用なゲノム編集法の構築を推進することができ、概ね順調であるとと判断した。

Strategy for Future Research Activity

候補分子をさらに充実させるため、２次元電気泳動とTOF-MS質量分析による分離同定を行う。同定された候補タンパク質が本当に石灰化に関与するかどうかを機能解析するために、候補分子の発現ベクターを構築する。発現ベクターを細胞に導入してタンパク質を精製する。精製したタンパク質を、骨芽細胞による石灰化実験系に添加することで、候補タンパク質の機能を解析する。

Causes of Carryover

予定していた２次元電気泳動の実験系よりも先にゲノム編集の実験系の確立を優先させたためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の計画に入れており、次年度に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Gene expression analysis of hypersensitivity to mosquito bite, chronic active EBV infection and NK/T-lymphoma/leukemia. (2017)
  • Author(s): Washio K, Oka T, Abdalkader L, Muraoka M, Shimada A, Oda M, Sato H, Takata K, Kagami Y, Shimizu N, Kato S, Kimura H, Nishizaki K, Yoshino T, Tsukahara H.
  • Journal Title: Leuk Lymphoma. Volume: 3 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1080/10428194.2017.1304762
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phytoestrogen Suppresses Efflux of the Diagnostic Marker Protoporphyrin IX in Lung Carcinoma (2016)
  • Author(s): Fujita H, Nagakawa K, Kobuchi H, Ogino T, Kondo Y, Inoue K, Shuin T, Utsumi T, Utsumi K, Sasaki J, Ohuchi H.
  • Journal Title: Cancer Res Volume: 76 Pages: 1837-1846
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-15-1484.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Aberrant differential expression of EZH1 and EZH2 in Polycomb repressive complex 2 among B- and T/NK-cell neoplasms. (2016)
  • Author(s): Abdalkader L, Oka T, Takata K, Sato H, Murakami I, Otte AP, Yoshino T.
  • Journal Title: Pathology. Volume: 48 Pages: 467-482
  • DOI: 10.1016/j.pathol.2016.05.002.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ラット顎下腺における活性酸素合成酵素の発現 (2017)
  • Author(s): 安部仁晴、中川敏浩、佐々木順造、渡邊弘樹
  • Organizer: 第122回日本解剖学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 長崎
  • Year and Date: 2017-03-28 – 2017-03-30
• [Presentation] Sensitive detection of dynamic changes of metabolic abnormalities during onset and progression of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL) and induction of specific leukemic cell death by photodynamic action. (2017)
  • Author(s): Takashi Oka, Masumi Sakata, Hajime Mizuno, Hirofumi Fujita, Tsutomu Masujima, Tadashi Yoshino, Yoshihisa Yamano and Atae Utsunomiya
  • Organizer: The18th International Conference on Human Retrovirology: HTLV and Related Viruses HTLV.
  • Place of Presentation: Tokyo
  • Year and Date: 2017-03-07 – 2017-03-10
• [Presentation] ヘム代謝制御に基づく光感受性物質protoporphyrin IX蓄積機構の研究 (2016)
  • Author(s): 藤田 洋史, 永川 恵介, 小渕 浩嗣, 荻野 哲也, 近藤 洋一, 井上 啓史, 執印 太郎, 内海 俊彦, 内海 耕慥, 佐々木 順造, 大内 淑代
  • Organizer: 第69回日本酸化ストレス学会学術集会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2016-08-30 – 2016-08-31