2016 Fiscal Year Research-status Report
培養ヒト骨格筋細胞を用いた運動誘発性横紋筋疾患の発症予防と発症予測に関する研究
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16K10938
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
河本 昌志 広島大学, 医歯薬保健学研究院(医), 教授 (40127642)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐伯 昇 広島大学, 病院(医), 助教 (30325170)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 悪性高熱症 / 培養骨格筋細胞 / カルシウム動態 / CICR速度 / ダントロレン / RYR1受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
●2016年4月から2017年3月までに，骨格筋の培養はCICR速度亢進6症例で行い，培養骨格筋細胞のカルシウム動態に関して分析を行った．
(1）当研究室に保存してある凍結ヒト培養骨格筋細胞21症例を解凍して，静止時のCa2+濃度（resting Ca2+）を測定後，CICR速度亢進+ resting Ca2+高値（A-H群 7例），CICR速度亢進+ resting Ca2+正常（A-N群7例），CICR速度正常+ resting Ca2+正常（N群 7例）に分類し検討を行った．
(2) RYR1刺激薬のEC50は（A-H群，A-N群，N群），カフェイン（2.56±0.13，2.92±0.11，5.19±0.35mM），ハロタン（1.43±0.16，1.35±0.18，3.48±0.11mM)， 4-CmC（111.4±11.1，134.7±12.8，250.0±16.5 μM）で，resting Ca2+は，107.1±2.7，74.2±0.76，75.1±1.8nMであった．
(3) SRのCa2+コンテントの推測では，A-H群が1038±54 で，A-N群1702±179，N群1543±147に比べ低く，Ca2+の貯蔵の減少が示唆された．(4) 50μMダントロレンのCa2+低下は，A-H群で最も大きかった（32.8±3.41，21.9±2.66，16.5±1.20nM）．(5) SRのCa2+コンテントに対する50μMダントロレンの影響は，A-H群で1.877±0.146倍とコンテントの増大が認められたが，A-N群とN群では，1.037±0.100，0.864±0.088であった．
(6) SRのCa2+枯渇時の細胞外からのCa2+ 流入速度は50μMダントロレンにより，3群とも抑制された（0.513±0.043, 0.523±0.034, 0.503±0.054）．以上のことより，ダントロレンのSR内カルシウム濃度への影響は，A-H群で1.877倍と大きく，A-N群とN群では1.037，0.864倍とほぼ正常であった．SRのCa枯渇時の細胞外からのCa流入速度はダントロレンにより，3群とも抑制された．よって悪性高熱症の素因を有する患者ではCICR亢進を呈する患者で，SRのCa濃度によってはダントロレンへの反応性に差がある可能性が示唆されるという結果が得られている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ダントロレンの作用に対する研究は、予定通り行った．今後はAICARとNACに効果に対する研究を行う予定である．
平成29年度に予定している熱耐性の研究について予備実験を行った結果，研究方法に修正が必要となった．
1. HBSSの潅流温度を28℃から43℃まで上昇では，測定時間が長くなり過ぎ再現性に問題があることがわかった．潅流温度は35℃から43℃に変更する．
2. 温度上昇に対するダントロレンのCa2+ 濃度上昇抑制作用についての研究においても，ダントロレン50μM存在したで温度上昇を行うと，細胞の反応そのものが極度に低下するため，濃度の再検討が必要となった．
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| Strategy for Future Research Activity |
RYR1のCa2+放出に対する温度の影響を検討するために，DHPRの影響がないとされるHuman Embryonic Kidney (HEK)293細胞を使用して、熱耐性の研究を追加する．
1. 従来から当研究室で作成してきたp.Arg2508CysおよびThr2206Met変異のあるRYR1遺伝子をHEK293へ導入し、myotubesと同様に熱耐性の研究を行う．
なおp.Arg2508Cysは，MHとCCDの併発が報告されているので，可能な限り追跡したい．
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| Causes of Carryover |
消耗品購入費が想定数より少なかったため経費支出が少額となったことが理由である．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度では消耗品の単価の高いものが必要となるため，若干の余裕はあるものの相当額を消費する予定である．
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