2016 Fiscal Year Research-status Report
末梢神経傷害後の組織酸素ダイナミクスとシュワン細胞機能調節機構の解析
| Project/Area Number |
16K10990
|
|---|
| Research Institution | National Center of Neurology and Psychiatry |
|---|
Principal Investigator |
氏家 悠佳 (小林悠佳) 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 疾病研究第五部, 流動研究員 (20511562)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | ミエリン形成 / シュワン細胞 / 末梢神経障害 / 低酸素誘導因子 / in vitro myelination |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
末梢神経における髄鞘化制御を担う候補分子の探索を行い、神経傷害後の神経の再生に繋がる治療薬ターゲットを提示することを目的とする。末梢神経のミエリン化には、正常なシュワン細胞分化制御が重要である。傷害神経におけるミエリンの再構築には発達期と同様の特定の転写因子の活性化を介したシュワン細胞分化過程が関与する。
ラット胎仔後根神経節のexplant cultureを用いたin vitro myelinationによる遺伝子スクリーニング解析から、神経発達に伴うミエリン形成関連分子としてHypoxia-induced factor 1α (HIF-1α)に着目した。HIF-1αは低酸素に応答して発現し、核内転写因子として働く。しかし、HIF-1αが末梢神経のミエリン関連遺伝子の発現に関与するかは不明である。予備実験により、神経挫滅モデルの坐骨神経におけるHIF-1αの発現変化を測定した結果、傷害前と比較してHIF-1αのタンパクレベルでの発現が増加していた。また、免疫染色により、神経傷害部位のシュワン細胞内にHIF-1αが局在することを明らかにした。シュワン細胞を低酸素環境下で培養すると、核内にHIF-1αを発現するシュワン細胞が増加し、ミエリン関連遺伝子（oct6, krox20, mbp）の遺伝子レベルでの発現増加が観察できた。HIF-1αはプロリン残基の水酸化により通常酸素条件では分解されてしまう。アミノ酸置換により水酸化による分解を受けないHIF-1α変異体を作製した。生後2日目ラットの坐骨神経由来のシュワン細胞にエレクトロポレーションを用いてHIF-1α変異体を過剰発現することでミエリン関連遺伝子の発現が増加した。シュワン細胞におけるHIF-1α発現とミエリン関連遺伝子の発現に相関性が得られ、HIF-1αの発現がシュワン細胞の分化誘導の引き金になる可能性が考えられる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
出産および育児のため研究を中断したため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
HIF-1αの発現様式を明らかにし、ミエリン関連遺伝子制御の直接的な制御の存在を検討する。また、病態モデルを用いて、HIF-1αの発現変化とミエリン化の関連性を調査する。発達期のミエリン化および傷害後の再ミエリン化におけるシュワン細胞でのHIF-1αの発現様式について調べる。生後数日の仔マウス、成体マウスおよび神経挫滅モデルの坐骨神経を用いて、HIF-1αのmRNAの発現変化についてリアルタイムPCRにより検討する。ミエリン形成に対するシュワン細胞のHIF-1αの発現の影響について検討するため、HIF-1α過剰発現またはノックダウンしたシュワン細胞とDRGの共培養によるin vitro myelinationを行う。ミエリン化の評価は免疫染色によるmbpセグメント数をカウントすることにより実施する。また、シュワン細胞のHIF-1αがミエリン関連因子発現の直接的な転写因子となる可能性を調べるため、mbpまたはkrox20のプロモーター領域にルシフェラーゼを組み込んだvectorを用いたpromotor assayにより検討する。HIF-1αの水酸化阻害薬（FG-4592）を用いてin vitro myelinationのミエリン化誘導に及ぼす影響を検討する。ミエリン化よりも脱ミエリン化が上回ることで末梢神経障害が引き起こされるPmp22Tr-Ncnpマウス（I型シャルコーマリートゥース病モデル）を用いて、HIF-1αの発現安定（FG-4592またはHIF-1α変異体の神経局所過剰発現）が再ミエリン化を促進し、症状が改善されるか坐骨神経の組織化学的解析および運動機能の行動学的解析により評価する。
|
| Causes of Carryover |
出産および育児のため研究を中断することになり、計画していた実験を次年度に実施することになった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度に計画していた実験に用いる実験動物代、生物学的・組織化学的解析に用いる試薬、ディスポーザブル実験機器等の購入に使用する。
|
