2016 Fiscal Year Research-status Report
FLCN遺伝子および細胞内代謝経路に着目した腎癌腫瘍化機構の解析研究
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16K11020
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
蓮見 壽史 横浜市立大学, 附属病院, 助教 (40749876)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢尾 正祐 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (00260787)
近藤 慶一 横浜市立大学, 附属病院, 准教授 (80363836)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 遺伝性腎癌 / BHD症候群 / FLCN/FNIP1/FNIP2複合体 / 細胞内輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はBirt-Hogg-Dube(BHD)症候群の原因遺伝子であるfolliculin (FLCN)およびその結合蛋白FNIP1およびFNIP2が構成する複合体の機能喪失が引き起こす発癌メカニズムの解明および腎癌治療薬の創薬基盤開発を目指しています。
最近の成果として、BHD症候群におけるFLCN胚細胞変異は殆どがナンセンス変異やフレームシフト変異ですが、我々はミスセンス変異であるH255Y変異とK508R変異が腎臓細胞の異常増殖を引き起こし、興味深いことにK508R変異がドミナントネガティブ効果を示すことを明らかにしました(Hum Mol Genet, 26: 354, 2017)。さらに共同研究の成果として、栄養状態依存的にFNIP1とFNIP2がSCFβ-TRCPによる蛋白分解調節を受け、結果としてFLCN複合体の局在が制御されていることを報告しました(Oncotarget, 8, 9947, 2017)。私達の施設は日本全国からBHD症候群の患者さんが集まる集中治療拠点となっておりますが、この特性を生かしてBHD症候群の120家系の集学的解析結果(Clin Genet, 90, 403, 2016)や、BHD関連腎癌から樹立した細胞株の樹立（Lab Invest, 97, 343, 2017）について報告しました。
これらの成果を最大限に活用し、本件研究課題では、リン酸化プロテオームを用いて、FLCN欠失細胞におけるリン酸化シグナル経路の詳細を明らかにし、腎癌治療薬の創薬基盤開発を行います。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までの進捗状況として、FLCN欠失腎癌細胞株UOK257のその他のクローン、FLCN欠失マウス線維芽細胞、FNIP1/FNIP2同時欠失マウス線維芽細胞に対するリン酸化プロテーム解析が終了しております。これら解析の結果、FLCN経路の欠失した細胞では、様々な蛋白のリン酸化状態が変化していることが明らかとなりました。特に細胞内輸送に関係した蛋白のリン酸化が変化しており、このことは、FLCN複合体が細胞内輸送に深く関わることをサポートしていると考えられます。
並行して動物モデルであるFLCNノックアウトマウス、FNIP1ノックアウトマウス、FNIP2ノックアウトマウスと、Ksp-Creトランスジェニックマウスの交配から、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスおよび腎臓特異的FNIP1/FNIP2ノックアウトマウスを作成し、リン酸プロテオームに必要な増殖性嚢胞様腎検体およびコントロールのための正常腎検体を採取しました。細胞と違い組織検体は臓器ごとにリン酸化蛋白質抽出方法の条件が異なると考えられ、現在、検体のホモジナイズの方法やバッファー条件などの条件検討を進めております。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスおよび腎臓特異的FNIP1/FNIP2ノックアウトマウスに発生する増殖性嚢胞様腎検体およびコントロールのための正常腎検体からのリン酸化蛋白質抽出条件を決定し、リン酸化プロテオーム解析を行います。この解析結果と、既に終了している細胞におけるリン酸化プロテオーム解析結果を統合し、FLCN欠失またはFNIP1/FNIP2同時欠失により変化するリン酸化シグナルを明らかにします。そして、明らかとなったリン酸化シグナルの細胞増殖における意義を明らかにします。具体的には、同定されたリン酸化シグナル分子に対するsiRNAや、責任酵素に対する阻害剤を用いて細胞増殖がどのように変化するかを調べます。さらに、そのリン酸化シグナルに対する責任酵素や、リン酸化プロテオームの結果の中に直接的に含まれるリン酸化酵素に対する阻害剤の有効性を、細胞増殖の系を用いて網羅的に調べ、FLCN欠失またはFNIP1/FNIP2同時欠失細胞の増殖を阻止するリン酸化酵素阻害剤を同定します。将来的には、同定されたリン酸化酵素阻害剤を、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスおよび腎臓特異的FNIP1/FNIP2ノックアウトマウスに投与することにより、増殖性嚢胞様腎の重量変化や、腎臓特異的FLCNノックアウトマウスおよび腎臓特異的FNIP1/FNIP2ノックアウトマウスの生存期間を観察し、新規腎癌治療薬としての可能性を探ります。
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| Causes of Carryover |
マウス腎臓を使ったリン酸化プロテオームの、さらなる条件検討が必要となったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
リン酸化プロテオームから得られた結果を、細胞モデルと動物モデルを用いて検証します。次年度使用額はアッセイキット購入のために使用します。
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[Journal Article] Establishment and characterization of BHD-F59RSVT, an immortalized cell line derived from a renal cell carcinoma in a patient with Birt-Hogg-Dube syndrome.2017
Author(s)
Furuya M, Hasumi H, Baba M, Tanaka R, Iribe Y, Onishi T, Nagashima Y, Nakatani Y, Isono Y, Yao M.
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Journal Title
Lab Invest
Volume: 97
Pages: 343 351
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] H255Y and K508R missense mutations in tumour suppressor folliculin (FLCN) promote kidney cell proliferation.2017
Author(s)
Hasumi H, Hasumi Y, Baba M, Nishi H, Furuya M, Vocke CD, Lang M, Irie N, Esumi C, Merino MJ, Kawahara T, Isono Y, Makiyama K, Warner AC, Haines DC, Wei MH, Zbar B, Hagenau H, Feigenbaum L, Kondo K, Nakaigawa N, Yao M, Metwalli AR, Marston Linehan W, Schmidt LS.
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Journal Title
Hum Mol Genet
Volume: 26
Pages: 354 366
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Genetic, epidemiologic and clinicopathologic studies of Japanese Asian patients with Birt-Hogg-Dube syndrome.2016
Author(s)
Furuya M, Yao M, Tanaka R, Nagashima Y, Kuroda N, Hasumi H, Baba M, Matsushima J, Nomura F, Nakatani Y.
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Journal Title
Clin Genet
Volume: 90
Pages: 403 412
DOI
Peer Reviewed
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