2017 Fiscal Year Research-status Report
去勢抵抗性前立腺癌に対する新規LSD1阻害剤とオートファジー制御による治療の開発
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16K11023
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
惠谷 俊紀 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (30600754)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河合 憲康 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20254279)
内木 綾 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (20509236)
安藤 亮介 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), その他 (30381867)
飯田 啓太郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 臨床研究医 (30713945)
安井 孝周 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40326153)
内木 拓 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (50551272)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アポトーシス / オートファジー / LSD1 / 去勢抵抗性前立腺癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成28年度の研究に引き続いて、in vitro実験としては、去勢抵抗性前立腺癌細胞株を用いて、LSD1阻害剤およびオートファジー阻害剤の抗腫瘍効果およびそのメカニズムについてさらに検討を進めた。PC3、PCai1、22Rv1の細胞株を用いて、WST-8アッセイでLSD1阻害剤とオートファジー阻害剤の効果について、単独および併用により抗腫瘍効果を検討した。両者の併用によって単独投与よりもさらに高い抗腫瘍効果が発揮されることを見い出した。さらに、Combination index法を用いて検討したところ、その効果としては相乗的効果が期待できることが見いだされた。また、透過型電子顕微鏡を用いて、LSD1阻害剤投与後の去勢抵抗性前立腺癌細胞株の形態学的変化を経時的に観察したところ、オートファゴソームの出現と、その後のライソゾームの増加が観察され、LSD1阻害剤投与によりオートファジーが誘導されていることが示された。また、オートファジー阻害剤であるクロロキン投与により、細胞質内でのオルガネラ分解処理が阻害されている像を認め、併用投与群ではこれらの所見が合わせて認められた。
動物モデルでの実験については、前年度の去勢抵抗性前立腺癌皮下移植モデルの標本の評価を継続して行った。摘出臓器の組織学的評価および血液生化学検査上は、LSD1阻害剤による明らかな有害事象は認めなかった。これにより、計画通りの週2回投与および投与量が適正であることの検討が行えた。また、摘出皮下腫瘍の免疫染色では、H3K4me2・H3K9me2等のLSD1関連タンパクの評価を行ったが、明らかな変化は認めなかった。LSD1阻害剤によるメチル化状態の変化を検出するには、免疫染色のみならず、クロマチン免疫沈降などの手法を皮下腫瘍の解析でも用いる必要がある可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitroでは、LSD1阻害剤とオートファジー阻害剤の併用効果についての検討がおおむね順調に進んでいる。今後はさらにこれらの阻害剤の効果のメカニズムの検証のため、どのような分子に作用しているのか、マイクロアレイ解析やクロマチン免疫沈降によりさらに詳細に検討する予定である。
In vitro実験については、オートファジー阻害剤の投与実験については本試験を行うには至っていないが、予備実験はすでに行い投与計画は完了しており、平成30年度に本試験を施行する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vitro実験においては、LSD1阻害剤とオートファジー阻害剤の併用により発揮される効果のメカニズムについて、透過型電子顕微鏡による観察や、細胞内小器官の多重免疫染色、酸化ストレス定量、マイクロアレイ解析、クロマチン免疫沈降などの実験手法も用いてさらに詳細に評価する。
In vivo実験については、上記のin vitro実験の結果も踏まえながら、LSD1阻害剤にオートファジー阻害剤を併用する去勢抵抗性前立腺癌皮下移植モデル実験を進めていく。LSD1阻害剤としてはNCL1およびNCD38を用いる。オートファジー制御との併用効果を検証するため、オートファジー阻害剤のクロロキン（CQ）を単独投与、あるいはLSD1阻害剤とCQを併用する群を設ける。LSD1関連タンパク、LC3やBeclin 1、p62、mTOR等のオートファジー関連タンパクのほか、in vitro実験でLSD1阻害剤あるいはオートファジー阻害剤の効果に関与するものとして推測された因子について、変化の有無を検討する。さらに、LSD1阻害剤およびオートファジー阻害剤の併用が生体に及ぼす影響はまだ明らかではないため、諸臓器を摘出し、重量及び組織変化で検証する。これらによりLSD1阻害剤およびオートファジー阻害剤投与における生体への影響を調べる。さらに、これらの薬剤の併用によりin vivoにおいても有意な併用効果が得られた場合は、各群の血液サンプルや皮下腫瘍を使用して、マイクロアレイ解析によるmRNAの発現変化の解析もしくは次世代シーケンサーによる遺伝子変異の検索を行う。
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| Causes of Carryover |
研究期間２年が経過し、研究結果が出始めたので追試をするところであった。時期的にH30年度になってしまったので次年度使用額が生じた。
オートファジー阻害剤の投与実験について、予備実験を繰り返し本実験に向けた投与計画を確立したい。
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