2016 Fiscal Year Research-status Report
1細胞RNAシークエンスを用いたヒト精子幹細胞ニッチの遺伝子発現解析
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16K11067
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
守時 良演 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 病院助教 (50595395)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安井 孝周 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40326153)
林 祐太郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (40238134)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (70448710)
西尾 英紀 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (10621063)
中根 明宏 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (70464568)
神沢 英幸 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (00551277)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 造精機能障害 / 精子幹細胞 / 幹細胞ニッチ / 1細胞RNA-sequence |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度はFACS(fluorescence activated cell sorting)を用いて、アダルトマウスの精巣を構成細胞ごとに分離する方法について検討を重ねていた。精巣の1細胞への単離は精細管基底膜の機械的、あるいは化学的な分離が必要である。まずは既存の報告に基づき、機械的な分離後にcollagenaseIとDNaseを用いて基底膜を分離した。精母細胞(Spermatocyte)と円形精子細胞(round spermatids)は細胞のサイズを用いて単離した。また生殖細胞(Germ cell)とセルトリ(sertoli)細胞は細胞表面マーカーとして、それぞれAlfa6/Beta1-integrinとZo-1を用いて単離した。Sertoli細胞は、代表的な細胞表面マーカーであるFsh受容体を用いての単離は困難であった(市販されている抗体が機能しないことが原因であった)。また筋様(myoid)細胞、ライディッヒ(Leydig)細胞は特異的な細胞表面マーカーに乏しく、分離が困難であった。単離した細胞はそれぞれ特異的なマーカーでqPCRを行った。問題点としては、大部分の精巣構成細胞が基底膜の破壊後に死ぬことであり、現在生存率(viability)を上げる、あるいは死細胞を除くための検討を行っているところである。
今後は、単離した細胞に対して行う1細胞からのRNA増幅の系を研究室で立ち上げることと、立ち上げた系を用いて分離した細胞群の純度の評価を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
原因として以下の4点が挙げられる。①精巣細胞を分離の際に、想定より大量の細胞が死んだこと②チューブやチップを含めて、細胞のロスがあったこと③FSH受容体抗体が機能しないことを確認するのに時間がかかったこと④Sertoli細胞を同定するための代替の細胞表面マーカーが見つからなかったこと。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、①単離した1細胞からのRNA増幅を研究室で立ち上げる。②立ち上げた系を用いて、FACSでより分けた細胞の純度を検討する③純度が問題なければ回収した細胞を用いてRNA-seqeunceを行うことで、停留精巣と正常精巣の違いについて遺伝子発現の比較を行う。
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